Микроскопическое свечение космического масштаба
17 апреля 2015
Микроскопическое свечение космического масштаба
- 3891
- 2
- 3
-
Автор
-
Редактор
Видели ли вы когда-нибудь свечение моря? Когда мириады крошечных «звезд» выбрасывает на берег прибоем? От этого зрелища невозможно оторвать глаз! Вопрос о том, что это за микроорганизмы-лампочки и какую роль они играют на нашей планете, вызывал интерес ученых многие десятилетия. В наше время исследователям удалось пролить свет на многие аспекты экологии, морфологии и систематики этих загадочных микроорганизмов — биолюминесцентных бактерий. Статья посвящена истории их открытия, исследованию механизмов свечения и применению их удивительных способностей в биотехнологии.
Любимый, мы подходим друг другу, как люциферин люциферазе!
Анекдот с сайта kot.sh.
Рандеву с живым светом
Неоднократно безлунными ночами моряки и рыбаки из разных стран наблюдали неясный светящийся след в кильватерной струе идущего судна, молочное свечение за кормой в виде пятен или полос, свечение прибоя или вспышки в потревоженной веслом воде. Многие из мореплавателей были суеверны и приписывали таинственным «огням» мистический смысл, слагали об увиденном легенды и поверия. Более смекалистые и просвещенные полагали, что море светится из-за растворенных в нем солей или окисляющегося фосфора. Так, до сих пор среди моряков ходит старое выражение «море фосфорится», возникшее в результате заблуждений прошлых лет.
Самые ранние упоминания о таинственном свечении моря обнаружены в древнекитайских книгах, написанных более 3000 лет назад. Позднее оно было описано в трудах древнегреческого мыслителя Аристотеля (384–322 гг. до н.э.) и древнеримского натуралиста Плиния Старшего (23–79 гг. н.э.). Однако опытные исследования механизмов, лежащих в основе биолюминесценции, выходящие за рамки простого описания, были предприняты гораздо позже — в конце XIX века. Первым исследователем механизмов биолюминесценции был Рафаэль Дюбуа (1849–1929 гг.), поставивший эксперимент с «горячими» и «холодными» экстрактами, который впоследствии стал классикой исследования биолюминесцентных систем. В своем эксперименте он использовал вытяжки из ткани светящихся органов светлячков Pyrophorus noctilucus, полученные гомогенизацией в горячей и холодной воде. Также он провел аналогичный опыт с экстрактами из двустворчатых моллюсков Pholas dactylus. Дюбуа обнаружил, что за свечение ответственны две фракции. Первую («горячий экстракт») — устойчивую к нагреву низкомолекулярную фракцию — он назвал люциферином*. Вторая («холодный экстракт») — теряющая активность при нагревании и имеющая белковую природу — была названа люциферазой. Хоть это слово и демонизировано религиозной традицией (Люцифером назвали падшего ангела), но оно имеет латинские корни: lux («свет») и fero («несу»), то есть попросту означает «несущий свет».
* — Последний из «расшифрованных» люциферинов, восьмой, был выделен из сибирского светящегося червя Fridericia heliota, охарактеризован и даже синтезирован сотрудниками ИБФ СО РАН и ИБХ РАН: «Биолюминесценция: возрождение» [1]. — Ред.
Светящиеся организмы можно встретить практически во всех царствах живой природы, кроме растений. Наиболее распространенным представителем биолюминесцентных организмов являются бактерии. Они вездесущи и обитают не только в морской воде, но и в устьях рек, и на суше, заселяя практически весь земной шар. Тем не менее по причине малого размера их изучение долгое время не представлялось возможным. Ситуация изменилась лишь в конце XIX века, когда в арсенале ученых появились надежные бактериологические техники и методы выделения чистых культур*.
* — Ситуация, к сожалению, изменилась лишь для части бактерий, культивировать большинство из них до сих пор не удается. Тем существеннее выглядит событие 2015 года: после 50 лет неудачных попыток наконец подобрали «экосистему» для выращивания в лаборатории жутко странной кишечной бактерии — «Иммуностимулирующие филаментные бактерии: наконец-то они приручены!» [2]. — Ред.
Одними из первых светящихся бактерий, которых удалось изолировать и вырастить на искусственной питательной среде с сохранением способности к свечению, были штаммы Micrococcus phosphoreum, впоследствии отнесенные к роду Photobacterium [3]. И пусть природа бактериального свечения не имеет никакого отношения к фосфору и по своим биофизическим характеристикам достаточно далека от фосфоресценции, видовое имя phosphoreum так и сохранилось.
Несмотря на многочисленные экспедиции по южным морям и экзотическим странам, целью которых было обнаружение и описание неизвестных ранее видов биолюминесцентных бактерий, бывали случаи, когда человек открывал новые виды совершенно случайно, сталкиваясь с ними в повседневной жизни. Порой даже в результате трагических событий. Так, документально известно, что впервые с бактериями рода Vibrio европейская цивилизация столкнулась в 1854 г. во Флоренции. В то время в регионе зверствовала эпидемия холеры, унесшая жизни множества людей. Исследуя слизистые оболочки кишечника погибших людей, итальянский врач Филиппо Пачини (1812–1883 гг.) обнаружил микроорганизмы в виде изогнутых палочек и описал их как вероятных возбудителей заболевания. Для того чтобы предотвратить распространение инфекции в Европе, известный микробиолог Роберт Кох (1843–1910 гг.) отправился в Египет, а затем в Индию, где в то время уже бушевала эпидемия холеры. В своей экспедиции ему удалось выделить чистую культуру возбудителей этого тяжелого заболевания, исследовав которую, он обнаружил холерный вибрион (Vibrio cholerae). За изогнутую форму бактерии противники ученого в насмешку прозвали вибрион «запятой Коха». Позднее были открыты другие представители рода Vibrio, в том числе люминесцирующие. V. cholerae, а также патогенный для человека вид Vibrio vulnificus, как правило, не светятся, но были зарегистрированы случаи, когда у больных, инфицированных V. vulnificus, и у погибших от холеры обнаруживались светящиеся штаммы [4, 5].
На сегодняшний день многие биолюминесцентные бактерии довольно хорошо изучены, но неожиданные встречи с ними до сих пор будоражат умы обычных людей. Так, в 2007 году в одной газете города Красноярска был описан любопытный случай — домохозяйка наблюдала слабое свечение свежемороженой сельди! Теряясь в догадках о том, что же с этой рыбой «не так», напуганная женщина решила, что та содержит большое количество фосфора или, что еще страшнее, радиоактивна! К счастью, именно в Красноярске, где произошла история со светящейся селедкой, в Институте Биофизики СО РАН еще в 1970-х годах сформировалась одна из самых крупных в мире исследовательских групп, занимающихся живым свечением [6], и в том числе биолюминесценцией бактерий, найденных в брюхе сельди. Так как история со светящейся рыбой вызвала немалый общественный резонанс, понадобилась помощь настоящих профессионалов. Ученые быстро пришли на выручку и разъяснили напуганным жителям города, в чем причина загадочного свечения. Рыбу признали безопасной и съедобной, хоть и посоветовали произвести термическую обработку продукта (не из-за люминесценции, конечно, а из-за банальных глистов).
Невероятная жизнь светящихся бактерий
Накопленные на сегодняшний день данные о таксономии бактерий свидетельствуют о том, что все люминесцирующие бактерии относятся к классу Gammaproteobacteria, который входит в отдел Proteobacteria домена Bacteria. Известно четыре рода водных светящихся микроорганизмов: Photobacterium, Vibrio, Aliivibrio и Shewanella, — а также один наземный, Photorhabdus (рис 1).
Многие люминесцентные бактерии, ответственные за свечение моря, живут «сами по себе», совершая свободные хаотичные блуждания в морской воде. Они, как правило, обитают в толще прибрежных вод, где их содержание может варьировать от 103 до 106 клеток на 1 л, составляя до 50% всех обнаруживаемых микроорганизмов [7]. При этом количественный и качественный состав бактериальной популяции зависит от местоположения, глубины, температуры воды, времени года и других факторов. Любопытно то, что свободноживущие микроорганизмы обычно пребывают в нелюминесцирующем состоянии. Для того чтобы запустился процесс свечения, бактериям необходимо «договориться» об этом! Для этого микроорганизмы выделяют в среду специальный химический сигнал — автоиндуктор, при высокой концентрации которого они все вместе «загораются», как лампочки. Такую слаженную работу отдельных бактериальных организмов называют «чувством кворума» [8, 9]. Нередко свечение толщи воды может происходить за счет ассоциации светящихся бактерий с микроводорослями Phaeocystis [10]. При этом люминесцентные бактерии формируют автономные микроколонии внутри агрегатов водорослей с локальным накоплением автоиндуктора и последующей генерацией свечения. Также биолюминесцентных бактерий можно обнаружить на мертвых органических агрегатах, взвешенных в воде и называемых «морским снегом».
Часто светящиеся микроорганизмы заселяют покровы и пищеварительный тракт морских позвоночных и беспозвоночных. Однако такое «сожительство» нельзя назвать симбиозом, так как при достижении критической численности популяции они вызывают болезнь и даже гибель организма-хозяина. Поэтому некоторых представителей родов Photobacterium и Vibrio относят к условным патогенам рыб, ракообразных и головоногих моллюсков. То же самое можно сказать о тех видах бактерий, которые каким-либо путем попадают внутрь теплокровных животных, включая человека.
Особый интерес научного сообщества вызывают виды светящихся бактерий, которые встречаются в специальных световых органах рыб и кальмаров. Симбиоз биолюминесцентных бактерий и многоклеточных животных — одно из самых удивительных изобретений эволюции! Вот уже несколько десятилетий биологи ломают головы, пытаясь разгадать таинственные механизмы коэволюции видов. К бактериям-симбионтам относят виды P. phosphoreum и V. logei, проживающие совместно с глубоководными рыбами и кальмарами в холодных водах, и P. leiognathi и V. fischeri (реклассифицирован как Aliivibrio fischeri), обнаруженные у обитателей поверхностных вод и теплых тропических морей.
Световые органы морских рыб и головоногих моллюсков называются фотофорами. Имея общее эктодермальное происхождение и схожий состав тканей, они могут сильно различаться по своему строению, размерам и расположению. Фотофор представляет собой полый орган, внутренняя поверхность которого состоит из крипт — щелей или канальцев, аналогичных углублениям слизистой оболочки кишечника. Поверхность крипт выстлана однорядным эпителием, проявляющим сильную секреторную активность. Образующийся секрет и отмершие клетки попадают в просветы между криптами и в полость органа, где их потребляют светящиеся бактерии. Фотофоры оснащены специальным выводным протоком, который сообщается с внешней средой непосредственно или через кишечный тракт и позволяет избавляться от отходов жизнедеятельности клеток и избыточной биомассы. Более того, существует целая сеть кровеносных сосудов, связанных со светящимся органом. Рыба способна рефлекторно контролировать их тонус, тем самым повышая или понижая концентрацию поступающего кислорода, который необходим для биолюминесценции [11].
С рыбами и прочими морскими «гадами» все ясно! В большинстве случаев можно понять, зачем им нужно свечение: для привлечения добычи (как это делает глубоководный удильщик) или отпугивания врага (в случае «плюющихся» световым облаком рыбы-кардинала, креветок и кальмаров). Но какая польза самим бактериям от генерации света? Может, дело в привлечении внимания более крупных организмов с целью паразитирования или взаимовыгодного проживания с ними? Скорее всего, это лишь вторичная причина. Ученые предполагают, что биолюминесценция у бактерий могла возникнуть как защитный механизм от окислительного стресса — в виде альтернативной дыхательной системы. Именно так светящиеся бактерии могли пережить «кислородную катастрофу» на ранних этапах формирования биосферы Земли. Возможно, что свечение — всего лишь способ дезактивации пероксида водорода, в результате чего энергия химической реакции не рассеивается в виде тепла, неблагоприятного для нормального функционирования клетки.
А кто тут, собственно, люциферин?
Накопленные к настоящему моменту данные о систематике бактерий, их экологических особенностях и морфологических признаках свидетельствуют об относительной эволюционной близости всех светящихся микроорганизмов. Это также объясняет наличие универсальной системы генерации свечения, единой для всех бактерий (но не для всех светящихся организмов!).
Основу биолюминесцентной системы составляет фермент бактериальная люцифераза. Она катализирует реакцию, в которой энергия химической реакции трансформируется не в тепло, как во многих других процессах, а в видимый зелено-голубой свет. В ходе этой реакции происходит окисление восстановленного флавинмононуклеотида (ФМН·H2) и алифатического альдегида (CH3(CH2)12CHO) кислородом воздуха (O2):
CH3(CH2)12CHO + ФМН·H2 + O2 → CH3(CH2)12COOH + ФМН + H2O + hν
В результате образуется окисленная форма флавинмононуклеотида (ФМН), миристиновая кислота (CH3(CH2)12COOH), молекула воды и квант света (hν).
Интересно, что, несмотря на относительную изученность химизма биолюминесцентной системы бактерий, на вопрос «Какой из субстратов является люциферином бактерий?» всё еще существует два ответа. Некоторые ученые считают, что, поскольку флавин чаще всего является кофактором (специальным соединением, необходимым для максимальной активности фермента), то люциферин бактерий — это альдегид. Другие же уверены в том, что роль люциферина играет как раз флавин, так как в результате химических перестроек в активном центре фермента именно его производное (гидроксифлавин) образуется в возбужденном состоянии и излучает фотон. В то же время, энергии окисления только ФМН·H2 недостаточно для излучения наблюдаемого кванта света, то есть энергетически оба соединения необходимы для биолюминесценции. Поэтому люциферином смело можно назвать и ФМН·H2, и альдегид! Хотя иногда термин «люциферин» по отношению к ним не используется, так как они имеют относительно простую химическую структуру и представляют собой распространенные в клетке многофункциональные метаболиты. Это отличает бактерии от других светящихся организмов, у которых люциферины — специализированные вещества со сложной структурой.
Другой особенностью работы бактериальной люциферазы является то, что ни один из двух субстратов не может быть ей доступен в большом количестве в виде «свободно плавающих» в цитоплазме веществ. Восстановленный флавин — очень неустойчивое соединение, а альдегид, по сути, является для клетки ядом. Как же могут бактериальные клетки поддерживать в таких условиях длительное яркое свечение? Считается, что эффективная работа бактериальной люциферазы обеспечивается сопряжением с другими ферментами. Это похоже на «фабрику света», состоящую из нескольких специализированных цехов. Альдегид поставляется в реакцию массивным комплексом восстановления карбоновой кислоты, состоящим из трех ферментов: трансферазы, синтетазы и редуктазы. Если молекулярный вес самой люциферазы составляет примерно 80 кДа, то комплекс — поставщик альдегида — весит практически 500 кДа! Восстановленный флавин «производит» фермент оксидоредуктаза, для работы которой необходима молекула НАД(Ф)·H. Практически у всех светящихся бактерий эти ферменты вместе с люциферазой закодированы в опероне luxCDABEG, что подразумевает их одновременный синтез и совместную работу. Однако как организована и согласована работа ферментов этой «фабрики света» всё еще неизвестно.
Особый интерес представляет процесс наработки и передачи люциферазе восстановленного флавина. Накопление ФМН·H2 в свободном виде тоже представляет опасность для клетки из-за того, что он подвержен быстрому автоокислению с формированием активных форм кислорода. Поэтому целенаправленная доставка восстановленного флавина в активный центр люциферазы, минуя клеточную среду, кажется необходимой. На данный момент существует две гипотезы о том, как осуществляется этот важнейший для биолюминесценции процесс поставки субстрата.
Согласно одной из гипотез, для производства флавина в клетке задействован целый ряд оксидоредуктаз, постоянно пополняющих пул свободного ФМН·H2 (рис. 2А). Помимо оксидоредуктазы LuxG, которая закодирована в биолюминесцентном опероне, эти функции также выполняют специфические флавин-зависимые оксидоредуктазы и так называемые оксидоредуктазы Fre-типа, впервые обнаруженные у E. coli. Они способны непрерывно пополнять пул ФМН·H2, который расходуется на нужды люциферазы и, возможно, участвует в сопряженных метаболических путях. Однако этот вариант никак не решает проблему образования опасной для бактерии перекиси водорода.
В рамках второй гипотезы происходит формирование короткоживущего комплекса между люциферазой и оксидоредуктазой (рис. 2Б). В этом случае субстрат реакции ФМН·H2 расходуется рационально, так как передается между ферментами «из рук в руки», без контакта со средой. Но комплекс между белками возможен только при наличии особой структурной специфичности. Поэтому остается неясным, как реализуется взаимодействие люциферазы с большим количеством непохожих друг на друга оксидоредуктаз.
Два противоборствующих лагеря ученых до сих пор ведут споры о том, какой из этих механизмов реализован в клетках люминесцентных бактерий. Опубликован целый ряд экспериментальных данных, как подтверждающих, так и опровергающих существование комплекса между люциферазой и оксидоредуктазой для контролируемой передачи флавина. Во многом изучение этого процесса осложнено невозможностью постановки прямого эксперимента в живой клетке, и исследователям приходится опираться на косвенные результаты, полученные в пробирке.
Живой свет в руках ученых
Биолюминесценция медуз, рачков, червей [1], грибов и бактерий изучается многие годы в Институте биофизики СО РАН и в Сибирском федеральном университете (бывшем Красноярском государственном университете) на кафедре биофизики. Под руководством академика РАН И.И. Гительзона в Красноярске сформировалась целая научная школа, представители которой изучили множество структур и механизмов, лежащих в основе биолюминесценции различных организмов.
В 2011 году в Сибирском федеральном университете совместно с ИБФ СО РАН была создана Лаборатория биолюминесцентных биотехнологий под руководством нобелевского лауреата 2008 года профессора Осаму Шимомура [12, 13]. В основные задачи лаборатории входят не только фундаментальные исследования, но и разработка и внедрение биотехнологических методик с использованием живого свечения. При этом люминесцентные бактерии считаются одним из наиболее привлекательных объектов для биотехнологических манипуляций и конструирования биотестов (рис. 3). А всё потому, что бактерии более просты в культивировании и менее прихотливы по сравнению с высшими растениями, грибами, водорослями и дафниями — излюбленными объектами, используемыми для биотестирования. Помимо этого, опыты показывают, что методики, опирающиеся на бактериальные ферменты биолюминесцентной реакции, обладают хорошей стабильностью, высокой чувствительностью и специфичностью, что обеспечивает быстрые и надежные результаты тестирования.
Так, на основе Lux-системы бактерий в Лаборатории биолюминесцентных биотехнологий создан целый ряд интегральных экспресс-методов для оценки токсичности почвы, воздуха, воды или снега. В них используется биферментная система бактерий, состоящая из люциферазы и оксидоредуктазы. Анализ интенсивности свечения такой системы после добавления в образец позволяет делать выводы о степени его загрязненности. В данный момент похожее биотехнологическое решение готовится для определения токсичности некоторых наноматериалов. Биолюминесцентный метод не отменяет методы аналитической химии, а успешно дополняет их, обеспечивая быструю и недорогую интегральную оценку токсичности различных проб как в лаборатории, так и в полевых условиях.
Красноярская лаборатория может похвастаться еще одной оригинальной методикой, которая на данный момент находится на завершающей стадии разработки. Речь идет о спортивной медицине и методе анализа слюны атлетов, позволяющем определять их функциональное состояние. Известно, что слюна — это биологическая жидкость, чрезвычайно чувствительная к различным изменениям в организме человека. В том числе она «реагирует» на тяжелые физические нагрузки. По интенсивности биолюминесцентной реакции в среде со слюной можно судить о том, насколько велика была нагрузка для конкретного спортсмена, насколько эффективна была его тренировка. Это дает надежду на то, что в скором времени в арсенале ученых и медиков появится экспресс-метод индивидуального контроля физического состояния спортсмена во время подготовки к соревнованиям. Такие технологии чрезвычайно важны для Красноярска, ведь он удостоился чести принимать зимнюю Универсиаду 2019 года!
Это не только интересно, но и красиво
Биолюминесценция всегда восторгала и волновала людей. На сегодняшний день известно многое о том, какие физические и химические процессы стоят за этим уникальным явлением природы. Однако многое еще не изучено и вызывает вопросы, оставляя место новым невероятным открытиям.
Какая бы наука не стояла за всем этим, свечение живых существ — зрелище поистине завораживающее своей красотой! Представьте, как на ваш день рождения к столу подносят светящийся торт? Как возвращаясь домой поздно вечером, вы идете по улице, освещенной не фонарями, а листьями-лампочками на деревьях? В наши дни несущие свет бактерии вдохновляют множество людей на создание удивительных творений, и кто знает, что ещё в будущем подарит нам этот чарующий живой свет?
Дополнительные ссылки:
- Проект «Светящийся лес».
- Biolume — компания, разрабатывающая специальные продукты на основе светящихся ферментов для использования в кулинарии, напитках и косметике.
- E.glowli Cambridge — проект, одним из направлений которого является создание освещения улиц с помощью светящихся деревьев.
Литература
- Биолюминесценция: возрождение;
- Иммуностимулирующие филаментные бактерии: наконец-то они приручены!;
- Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М.: Наука, 2009. — 246 с.;
- Oliver J.D., Roberts D.M., White V.K., Dry M.A., Simpson L.M. (1986). Bioluminescence in a strain of the human pathogenic bacterium Vibrio vulnificus. Appl. Environ. Microbiol. 52, 1209–1211;
- Kaeding A.J., Ast J.C., Pearce M.M., Urbanczyk H., Kimura S., Endo H. et al. (2007). Phylogenetic diversity and co—symbiosis in the bioluminescent symbioses of «Photobacterium mandapamensis». Appl. Environ. Microbiol. 73, 3173–3182;
- Комина М. (2015). Евгений Высоцкий: «Живой свет океана пришёл в Красноярск». Городские новости Красноярска. 3119;
- Nealson K.H., Hastings J.W. (1979). Bacterial bioluminescence its control and ecological significance. Microbiol. Rev. 43, 496–518;
- Элементы: «“Чувство кворума”: принятие коллективных решений в макро- и микромире»;
- Элементы: «Одиночные клетки переходят к коллективной жизни случайно, но отказываются от нее закономерно»;
- Nealson K.H., Hastings J.W. (2006). Quorum sensing on a global scale: massive numbers of bioluminescent bacteria make milky seas. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2295–2297;
- Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е. и др. Светящиеся бактерии / Отв. ред. Е.Н. Кондратьева. Новосибирск: Наука, 1984. — 278 с.;
- Борисова А. (2011). «Интерес к биолюминесценции сохранился только в России». Сайт «Газета.ру»;
- Булгакова Н. (2013). В свете свечения. Биолюминесценция выявила системные проблемы мегагрантов. Поиск. 41..