Двенадцать модельных организмов

Привет! Меня зовут Сергей Мошковский. Дорогая редакция «Биомолекулы», выпустив настенный календарь о модельных организмах на 2020 год, заказала было мне лонгрид, который должен был, как суровый конвой, сопровождать календарь на сайте. Минутная слабость — сколько их было в жизни! — и я уже соглашаюсь. Но как писать? Ведь о каждой модельной скотинке, нарисованной на календаре, — как и о нескольких десятках не поместившихся туда, — написаны тома научной и даже популярной литературы. Придется писать не по-журналистски, из головы — как бы не вышло чего-то вроде поэмы «Москва — Петушки», где вместо станций — модельные организмы. Я и еще несколько авторов представляем вам на суд собранье пестрых глав — они будут выходить в течение всего 2020 года. Читатель, прости! Ты знаешь, кого за это винить!

Простейшая модель эукариот — Неожиданные особенности — Синтетические дрожжи — Гаплоидный мицелий для биохимии и генетики

В этот раз наш модельный организм — одноклеточные грибы пекарские (или пивные, кому как больше нравится) дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Они несут нам запах браги и хлеба — запах лаборатории, в которой работают с дрожжами. Но не только запах! Дрожжи изо всех сил помогают нам добыть новые знания о природе. Несмотря на то, что клетка дрожжей в десятки раз меньше крупицы песка из знаменитого стихотворения Уильяма Блейка, исследователи уже извлекли из нее целое море информации. Если кому интересно погрузиться в это море, тот может начать с «Книги дрожжей». Однако дрожжи — не первый гриб, поселившийся на чашках Петри и лабораторных полках. Пока генетики только укрощали дрожжи, их место в лаборатории занимала красная хлебная плесень — нейроспора густая. Как клубочек ниток в русских сказках, она помогала исследователям сделать первые шаги в мире биохимии и генетики эукариот.

Пекарские дрожжи — живые пробирки

Давайте представим себе, что возникла необходимость исследовать молекулярную и клеточную биологию с чистого листа. Какой объект выбрать для опытов в качестве модели эукариотической клетки? Желательно, чтобы:

1. Наш «идеал» был всегда под рукой, и не приходилось ждать по нескольку лет (и даже дней!), пока подрастет новое поколение (слона — вычеркиваем).
2. Работа с этим объектом не требовала больших материальных затрат и не была сопряжена с риском для здоровья (в том числе душевного!) экспериментаторов.
3. Была возможность легко модифицировать его гены.
4. При этом модельный объект был адекватной моделью для человека — мы хотим понять, как устроены мы сами!

Вы, наверное, уже догадались, что всем этим условиям прекрасно соответствуют пекарские дрожжи (не зря им, как и некоторым другим модельным объектам из нашего путеводителя, поставили памятник — взгляните на рисунок 1!).

Вот некоторые приятные достоинства дрожжей:

1. Время удвоения биомассы стандартного лабораторного штамма дрожжей составляет всего полтора часа. Это означает, что из одной клетки можно вырастить миллион клеток чуть более чем за сутки. А миллиона клеток с избытком хватит для самых разных экспериментов.
2. Пекарские дрожжи повсеместно используются в быту — наверняка и у вас завалялся пакетик фирменных дрожжей в шкафу на кухне. При этом они обычно не представляют никакой угрозы человеку. Впрочем, описаны и редкие случаи «нападения» пекарских дрожжей на людей с ослабленным иммунитетом [1].
3. Огромным плюсом пекарских дрожжей является то, что у них постоянно активна система гомологичной рекомбинации. Поэтому попавшая в цитоплазму клетки двухцепочечная ДНК имеет неплохие шансы встроиться в ее геном. Это сильно упрощает задачу получения на основе дрожжей всевозможных мутантов и их дальнейшее исследование. В современном мире жизнь еще сильнее упростилась: можно купить коллекцию штаммов, в которых, например, нокаутированы все нежизненноважные гены или к каждому гену пришит ген флуоресцентного белка.
4. Еще одним достоинством дрожжей как модельного объекта является их жизненный цикл: пекарские дрожжи способны вегетативно размножиться как с одиночным (1n), так и с удвоенным (2n) набором хромосом (рис. 2). Это очень удобно для исследования функций генов: в гаплоидных клетках достаточно удалить (нокаутировать) одну копию гена, чтобы посмотреть, как дрожжи заживут без него! Около 5000 из 6000 генов не являются жизненно необходимыми, однако делеция любого из оставшейся 1000 генов не совместима с жизнью клетки. Вероятно, главный вклад дрожжей в биологию — с их помощью определено множество ассоциацией фенотипов с генотипами (то есть то, как наличие или отсутствие определенного гена влияет на свойства живой клетки) [2]. А это и есть важнейшая задача генетики.



5. Наконец, несмотря на внешние различия, дрожжи, как выясняется, во многом похожи на людей! Последний общий предок грибов и людей жил около миллиарда лет назад [3]. За это время в нуклеотидных последовательностях генов в результате мутаций, случайного дрейфа и отбора накопилось довольно много различий: аминокислотная последовательность белков человека и соответствующих им белков дрожжей совпадают на (приблизительно) треть. Однако если мы возьмем жизненно важный ген дрожжей, удалим его из генома, а вместо него добавим соответствующий (паралогичный) ген человека, то в половине случаев дрожжи смогут жить почти как ни в чем не бывало [4]. Другими словами, половина дрожжевых генов взаимозаменима с генами человека, а белки, закодированные в этих генах, выполняют ту же функцию с точностью до отдельных деталей механизма!

Достоинства дрожжей не ограничиваются вышеперечисленным. Пекарские дрожжи — факультативные анаэробы и прекрасно живут за счет гликолиза, если их митохондрии перестают выполнять свои функции, связанные с преобразованием энергии . Это позволяет исследовать штаммы, в которых нарушены гены, необходимые для работы митохондрий [5]. Работать с мутантными по этим генам клетками животных, которые сильно зависят от клеточного дыхания, намного сложнее . Так, например, именно в пекарских дрожжах были открыты белки, отвечающие за деление и слияние митохондрий. Более того, дрожжи являются единственным ядерным организмом, у которого удается направленно модифицировать митохондриальную ДНК. Наконец, S. cerevisiae, пусть и с рядом ограничений, используют в качестве модели для изучения патогенных грибов [6].

На самом деле кислород нужен дрожжам не только для дыхания: биосинтез эргостерина (грибной аналог холестерина человека) у дрожжей включает несколько реакций с молекулярным кислородом. В условиях анаэробиоза дрожжи теряют не только способность к окислительному фосфорилированию, но и возможность самостоятельно синтезировать эргостерин (а потому вынуждены захватывать его из среды).

О важной роли митохондрий в жизни животной клетки и заболеваниях, связанных с нарушением функций этих клеточных энергостанций, рассказывает спецпроект «Биоэнергетика». — Ред.

Однако наши достоинства часто являются продолжением наших недостатков. Так, и у пекарских дрожжей есть ряд удивительных особенностей, которые сильно отличают их от других эукариот. Многие из этих особенностей появились вследствие большой скорости деления. Так, например, пекарским дрожжам свойственен закрытый митоз, при котором ядерная оболочка не разрушается в процессе деления клетки. Лишь небольшая часть генов в ядре содержит интроны (это тоже адаптация к высокой скорости деления), зато в митохондриальных генах есть интроны и даже встроенные в интроны гены нуклеаз, а сама митохондриальная ДНК не кольцевая (как у человека), а... никто до сих пор толком не знает какая. Большой вопрос — взяли бы мы дрожжи в качестве модели, если бы знали все эти чудеса заранее!

Пекарские дрожжи стали первым эукариотическим организмом, для которого была полностью прочитана последовательность ядерной ДНК [7]. По всей видимости, они также будут первым эукариотическим организмом с синтетическим (полностью переписанным человеком) геномом. Международный консорциум лабораторий постепенно замещает последовательность ДНК дрожжей последовательностью, сильно отредактированной человеком [8]. Вот только часть из осуществляемых модификаций:

1. Удаляют все дуплицированные гены и интроны.
2. «Освобождают» один стоп-кодон (делают так, чтобы он никогда не встречался в геноме). В будущем этот кодон можно будет использовать для того, чтобы интегрировать в белки новые аминокислоты [9]!
3. По всему геному расставляют метки — чтобы потом можно было легко понять, что это за участок генома.

Но, конечно, жизненно важные последовательности оставляют нетронутыми. Таким образом уже полностью «переписано» несколько из 16 дрожжевых хромосом [10]. Когда проект будет завершен, мы получим первый искусственный (конечно, только до определенной степени) эукариотический модельный объект, который оптимизирован для лабораторных исследований.

Пока синтетические дрожжи только конструируются в лабораториях, исследователи используют штаммы пекарских дрожжей, которые уже существенно отличаются и от промышленных штаммов, и от своих «диких» предков из Китая. (Да! По последним сведениям, центр происхождения пекарских дрожжей — Китай [11].) Что же пришлось сделать с пекарскими дрожжами, чтобы из них получился действительно удобный для работы модельный объект?

1. Во-первых, большинство лабораторных штаммов содержит мутации в гене флоккулинов (белков межклеточной адгезии дрожжей) и поэтому неспособны к образованию больших внеклеточных агрегатов [12]. Оно и понятно: эти агрегаты мешают исследовать клетки, так как внутри каждого агрегата возникают неповторимые условия, а доставка веществ вглубь агрегата затруднена.
2. Во-вторых, в лабораторных штаммах обычно нарушены гены биосинтеза некоторых аминокислот и азотистых оснований, и без их внесения в среду такие дрожжи просто не смогут расти. Такое ограничение (ауксотрофность) значительно облегчает процедуры селекции, обычно сопровождающие генетические манипуляции с дрожжами.
3. Наконец, в лабораторных штаммах выключена возможность спонтанной смены типа спаривания у гаплоидных штаммов (у грибов обычно различают не пол, а «тип спаривания»)! «Дикие» дрожжи способны к внутрихромосомной генной конверсии, которая приводит к спонтанной смене типа спаривания. Эта их особенность делает практически невозможным стабильное поддержание гаплоидных штаммов в культуре: если вы будете поддерживать культуру гаплоидных клеток одного типа спаривания, то рано или поздно одна из клеток поменяет тип спаривания и скрестится с другими, образовав диплоидную клетку. В результате в культуре клеток окажется смесь гаплоидных и диплоидных штаммов, что внесет путаницу. Поэтому сейчас в лабораториях работают со штаммами, в которых нарушен ген, отвечающий за смену типа спаривания!

Клубочек гиф помогает сделать первые шаги

Наличие спонтанной смены типа спаривания у пекарских дрожжей несколько затрудняло их научное использование на заре генетики. Поэтому первые исследования, позволившие связать науку о наследственности (генетику) со знанием о биохимических процессах, протекающих в живых организмах, были проведены с использованием другого модельного гриба — Neuróspora crássa (нейроспоры густой). Так же, как и пекарские дрожжи, нейроспора — это сумчатый гриб, бóльшая часть жизненного цикла которого проходит в гаплоидном состоянии (c единичным набором хромосом). Нейроспора формирует мицелий, за ростом которого бывает поучительно наблюдать (см. видео). В отличие от пекарских дрожжей, гаплоидный мицелий Neurospora crassa не способен к смене типа спаривания.

В начале прошлого века Neurospora crassa оказалась востребованным объектом для исследований биохимических процессов, протекающих в эукариотической клетке. Вы только посмотрите на эту впечатляющую хронологию работ по нейроспоре: Neurospora Chronology 1843–2002 [13]! В 1941 году Эдуард Тейтем и Джордж Уэлс Бидл опубликовали статью, в которой показали, что, облучая клетки нейроспоры, можно получить ауксотрофных мутантов, которые неспособны расти без добавленных в среду культивации тех или иных витаминов (рис. 4) [14]. Позднее они же показали, что такие ауксотрофности наследуются согласно законам генетики: при скрещивании штамма, неспособного расти без добавленной парааминобензойной кислоты, с нормальным штаммом «дикого типа» нейроспора образовывала сумки (аски), где в соотношении 1:1 присутствовали как ауксотрофные, так и прототрофные споры различных типов спаривания (рис. 3 и 4).

Нейроспора довольно быстро была вытеснена из исследовательских лабораторий пекарскими дрожжами. Оказалось, что работать с отдельными клетками дрожжей проще, чем с гифами нейроспоры, которые к тому же постоянно образуют летучие бесполые споры! Однако нейроспора и после появления дрожжей послужила основой для ряда открытий: с ее помощью в качестве модельного объекта опубликованы важные работы о генной конверсии, циркадных ритмах и поляризации клетки в растущих гифах.

...Сейчас целых два периодических научных журнала посвящены дрожжам: Yeast и Yeast Research. Это не удивительно ввиду их прошлых и настоящих научных заслуг (рис. 4). Раньше же статьи о дрожжах часто публиковались в ботанических журналах [15], и даже сейчас биологию грибов изучают в рамках курса ботаники. Однако грибы по родству ближе к животным, чем к растениям! Так что грибы не очень хорошая модель для изучения растений: у растений есть своя модель — небольшая резуховидка Таля. Может быть, вы знаете ее под названием «арабидопсис». Но даже если вы с ней не сталкивались, то просто дождитесь следующего месяца!

Литература

1. Roberto Pérez-Torrado, Amparo Querol. (2016). Opportunistic Strains of Saccharomyces cerevisiae: A Potential Risk Sold in Food Products. Front. Microbiol.. 6;
2. David Botstein, Gerald R. Fink. (2011). Yeast: An Experimental Organism for 21st Century Biology. Genetics. 189, 695-704;
3. E. J. P. Douzery, E. A. Snell, E. Bapteste, F. Delsuc, H. Philippe. (2004). The timing of eukaryotic evolution: Does a relaxed molecular clock reconcile proteins and fossils?. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101, 15386-15391;
4. A. H. Kachroo, J. M. Laurent, C. M. Yellman, A. G. Meyer, C. O. Wilke, E. M. Marcotte. (2015). Systematic humanization of yeast genes reveals conserved functions and genetic modularity. Science. 348, 921-925;
5. Denichiro Otsuga, Brian R. Keegan, Ellen Brisch, John W. Thatcher, Greg J. Hermann, et. al.. (1998). The Dynamin-related GTPase, Dnm1p, Controls Mitochondrial Morphology in Yeast. The Journal of Cell Biology. 143, 333-349;
6. Liesbeth Demuyser, Patrick Van Dijck. (2019). Can Saccharomyces cerevisiae keep up as a model system in fungal azole susceptibility research?. Drug Resistance Updates. 42, 22-34;
7. 12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот;
8. Синтетическая хромосома;
9. Расширенный геном;
10. Synthetic yeast genome (special issue). (2017). Science. 355;
11. Jackson Peter, Matteo De Chiara, Anne Friedrich, Jia-Xing Yue, David Pflieger, et. al.. (2018). Genome evolution across 1,011 Saccharomyces cerevisiae isolates. Nature. 556, 339-344;
12. Элементы: «Сложные колонии пекарских дрожжей»;
13. D D Perkins, R H Davis. (2002). Neurospora Chronology 1843-2002. Fungal Genetics Reports. 49, 4-8;
14. G. W. Beadle, E. L. Tatum. (1941). Genetic Control of Biochemical Reactions in Neurospora. Proceedings of the National Academy of Sciences. 27, 499-506;
15. F. V. Hereward. (1974). Cytoplasmic microtubules in a yeast. Planta. 117, 355-360;
16. E. L. Tatum, G. W. Beadle. (1942). Genetic Control of Biochemical Reactions in Neurospora: An "Aminobenzoicless" Mutant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 28, 234-243.