https://www.dia-m.ru/catalog/reactive/?utm_source=biomol&utm_campaign=up-baner#reactive-order
Подписаться
Оглавление
Биомолекула

Молекулярные машины — новые герои антибиотикотерапии

Молекулярные машины — новые герои антибиотикотерапии

  • 188
  • 0,0
  • 1
  • 1
Добавить в избранное print
Новость

Антибиотики, к которым у бактерий развилась резистентность, нуждаются в помощи. Молекулярная машина «просверливает» дыру в клеточной мембране патогена, облегчая попадание лекарства вовнутрь.

рисунок автора

Можно ли повернуть вспять неумолимую способность бактерий приспосабливаться? Есть ли шанс сохранить силу антибиотиков, но при этом «перешагнуть» через адаптивные механизмы бактерий? В статье журнала Science Advances ученые из Университета Райса (Техас, США) рассказывают о разработке молекулярных машин, способных «просверлить» брешь в мембране бактерий, что поможет антибиотикам попасть в клетку.

Резистентность бактерий — глобальная проблема, которая становится причиной смерти людей по всему миру и ежегодно уносит жизни порядка 700 000 человек. Более того, есть опасения, что к 2050 году около 10 млн человек будут ежегодно подвергаться риску умереть от микробной инфекции [1]. Проблема обостряется тем, что многие разрабатываемые препараты, хоть и относятся к новым классам лекарственных средств, проблему резистентности не решают. Подробнее о нависшей угрозе можно прочитать в спецпроекте «Биомолекулы»: «Антибиотики и антибиотикорезистентность».

Задача — найти средство, способное нейтрализовать защиту бактерий, чтобы вернуть антибиотикам былую славу. Возможно, решение найдено.

Неутомимые двигатели жизни

Молекулярными машинами (ММ) называют структуры, которые могут манипулировать объектами на молекулярном уровне: передвигать, состыковывать, собирать, разбирать. При этом молекулярным машинам нужен стимул или топливо — химическое, фото- или электрохимическое.

Как правило, молекулярные машины подразделяют на биологические и искусственно синтезированные. К первым, например, относится кинезин (перемещает груз от ядра по микротрубочкам; рис. 1), АТФ-синтаза (за счет энергии протонных градиентов, подобно турбине, синтезирует АТФ), ДНК-полимераза (участвует в репликации ДНК) и многие другие.

Классическая молекулярная машина

Рисунок 1. Классическая молекулярная машина. Белок кинезин транспортирует груз, «шагая» по микротрубочке.

К бою готов

Молекулярная нанотехнология позволила создать искусственные молекулярные машины — модифицированные молекулы. Аналог со сборкой автомобиля здесь неуместен: молекулярные машины названы так потому, что способны двигаться, а не потому что человек может сконструировать молекулярного киборга и отправить его на борьбу с патогеном. В перспективе они станут мощнейшим инструментом наномедицины — например, для обнаружения и уничтожения раковых клеток [4], [5]. В борьбе с микробными патогенами ММ имеют весомое преимущество — бактерии не готовы к встрече с ними. Человек способен контролировать пространственное расположение и активность молекулярной машины, что позволяет смягчить негативный эффект на клетки хозяина (то есть человека).

Ученые из Университета Райса исследовали, могут ли молекулярные машины помочь антибиотикам [6]? Созданные ими ММ способны проникать внутрь клетки, подчиняясь управлению извне. Чтобы они заработали, необходим стимул — свет: его удобно регулировать, он не инвазивен и не оказывает побочных эффектов (в отличие от химических стимулов).

При разработке исследователи опирались на работу коллег, опубликованную в Nature в 2017 году [7]. Именно в ней ученые показали, что молекулярные машины при нанесении на липидный бислой и последующей активации светом, способны «сверлить» отверстия. Составные части ММ назвали ротором и статором, проводя аналогию с частями электродвигателя, хотя обе части в молекуле остаются подвижными. Роторная часть получила такое название из-за добавления функциональных групп, которые позволяют управлять ММ и направлять ее.

Активация светом стала возможна благодаря добавлению амино- или алкокси-группы, которые стали электронодонорными заместителями в сопряженном ядре ММ и повысили электронную плотность. Одна из двух частей машины (статорная или роторная) была дополнительно модифицирована аминами для лучшего связывания с отрицательно заряженной мембраной бактерий (химическая структура ММ представлена на рис. 2). Кстати, принцип использования положительно заряженных молекул в борьбе с микробными патогенами далеко не нов: он используется как в антибиотикотерапии, так и в разработке антимикробных пептидов [8].

Химическая структура шести ММ

Рисунок 2. Химическая структура шести ММ, усиливающих эффект антибиотиков.

Добавленные функциональные группы выделены красным и синим цветом.
MW — молекулярная масса.

Роторная часть ММ после облучения начинает однонаправленно вращаться с частотой около 0,003 ГГц. Такая скорость вращения позволяет разрушать клеточную стенку и мембрану, а не просто проникать сквозь нее (рис. 3). Механическое нарушение целостности клеточной стенки и мембраны, приводящее к потере мембранного потенциала, инициирует действие антибиотиков, которые больше не сталкиваются с защитой бактерий, проникают внутрь и успешно оказывают клинический эффект. (Впрочем, это наиболее актуально для антибиотиков, разрушающих рибосомальные субчастицы, а не клеточную стенку.) В перспективе подобные ММ можно использовать для доставки и других лекарств в клетку.

Молекулярная машина проникает сквозь билипидный слой

Рисунок 3. Молекулярная машина после активации светом проникает сквозь билипидный слой.

В борьбе с резистентностью бактерий

Ученые из Университета Райса, после первой серии экспериментов на Escherichia coli, обнаружили, что незначительная разница в скорости вращения ММ не сказывалась на антибактериальном эффекте. При помощи моделирования молекулярной динамики выявлены различия в отношениях углов оси ММ и мембраны бактерии у разных машин. Так, ось ММ1 почти параллельна мембране (угол составляет около 15°), а для оси ММ2 угол около 60°. Угол вхождения в мембрану, который различался у разных ММ, оказывал влияние на степень деформации мембраны бактерии и итоговый антибактериальный эффект. Деформацию мембраны изучали при помощи обработки клеток флуоресцентным красителем — йодистым пропидием, и последующим измерением уровня флуоресценции.

Схематичное изображение расположения разных ММ

Рисунок 4. Схематичное изображение расположения разных ММ во время движения в мембране.

Угол вхождения зависит от функциональных групп молекулы — так говорят данные молекулярной динамики.

Шесть самых эффективно действующих ММ задействовали в экспериментах на других грамположительных и грамотрицательных бактериях, в том числе золотистом стафилококке (Staphylococcus aureus). Рекордсменом в скорости его уничтожения стала ММ4 — снижение количества клеток в биопленке до нижнего предела обнаружения при помощи АТФ-метрии составило всего две минуты от момента активации. При добавлении к биопленкам с синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa) и S. aureus таких антибиотиков как рифампин и тобрамицин количество бактериальных клеток снижалось до 43 и 64%, соответственно. При этом, одновременное с антибиотиками добавление ММ снижало общее количество клеток до 78%. Антибиотики и молекулярные машины сообща действовали эффективнее, нежели по отдельности. Дальнейший анализ подтвердил, что повышение уровня воздействия антибиотиков на бактерий достигнуто благодаря возникновению пор в клеточных стенках, что облегчало лекарственному средству доступ вовнутрь.

Отмечено, что повторное использование ММ не приводило к развитию резистентности к ним. После 20 циклов развилась резистентность к антибиотикам, но устойчивость к молекулярным машинам так и не возникла, в связи с особенностями механизма действия — ММ не ингибируют белки, а напрямую повреждают мембрану. Впрочем, это утверждение стоит проверить на большем количестве циклов и разнообразии патогенов.

При воздействии молекулярных машин наблюдались существенные изменения в морфологии клеток: внутренняя мембрана отделялась от клеточной стенки, в слое пептидогликана возникали бреши, в результате мембранного и периплазматического стресса на наружной мембране образовывались везикулы. На рисунке 5 представлены клетки, целостность которых нарушена при помощи ММ.

Изображение клеток E. coli

Рисунок 5. Изображение клеток E. coli, полученные при помощи просвечивающей электронной микроскопии.

Крайняя слева клетка (контроль) обработана 1%-раствором диметилсульфоксида, который повышает проницаемость клеточной стенки бактерий в присутствии антибиотиков.
На следующих трех снимках представлены клетки после воздействия трех разных ММ в минимальной ингибирующей концентрации.

ММ снижает смертность зараженных бактериями личинок моли

Рисунок 6. ММ снижает смертность зараженных бактериями личинок большой восковой моли.

У одной группы личинок Galleria mellonella ожоговую рану инфицировали грамположительным S. aureus, а у другой группы грамотрицательным — A. baumannii. Раны обрабатывали смесью антибиотиков без и с добавлением разных ММ. Выживаемость отслеживали в течение 7 дней.
На графиках отмечена выживаемость разных групп личинок в течении недели: тех, чьи раны были обработаны только антибиотиком, 1% раствором DMSO или раствором с ММ.
Добавление молекулярных машин оказало самый сильный эффект.

Исследователи обратили внимание, что ММ уничтожали также и клетки-персистеры — бактериальные популяции, которые находятся в состоянии покоя . Обычно из-за «сна» такие фракции крайне устойчивы к антибиотикам, но не в случае использования ММ! Неожиданно молекулярные машины могут справиться и с этой затаенной угрозой.

Эта способность великолепна для бактерий, однако может стать роковой для людей — подробнее читайте в статье «Персистенция бактерий — угроза, которую мы не замечаем в страхе перед антибиотикорезистентностью».

Заключение

Молекулярные машины механически нарушают целостность клеточной стенки, тем самым способствуя гибели бактерии. Появление пор в клеточной стенке позволяет антибиотику преодолеть резистентность бактерий и проникнуть внутрь. Исследователям предстоит продолжить эксперименты, задействуя модельные организмы, чтобы подойти к подтверждению терапевтического эффекта на людях. Но есть надежда, что молекулярные машины, свободные от угрозы резистентности, станут ключевыми героями в борьбе с бактериальной угрозой.

Литература

  1. O’Neill J. (2016). Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. Review on antimicrobial resistance;
  2. Антибиотики и антибиотикорезистентность: от древности до наших дней;
  3. Kinesin Motor Protein With Vesicle. (2022). Xvivo;
  4. Маленькое будущее;
  5. «Врачи-нанороботы» — миф или реальность?;
  6. Ana L. Santos, Dongdong Liu, Anna K. Reed, Aaron M. Wyderka, Alexis van Venrooy, et. al.. (2022). Light-activated molecular machines are fast-acting broad-spectrum antibacterials that target the membrane. Sci. Adv.. 8;
  7. Víctor García-López, Fang Chen, Lizanne G. Nilewski, Guillaume Duret, Amir Aliyan, et. al.. (2017). Molecular machines open cell membranes. Nature. 548, 567-572;
  8. Антимикробные пептиды — возможная альтернатива традиционным антибиотикам;
  9. Персистенция бактерий — угроза, которую мы не замечаем в страхе перед антибиотикорезистентностью.

Комментарии