Конкурс «Био/Мол/Текст»-2022/2023

Эта работа опубликована в номинации «Своя работа» конкурса «Био/Мол/Текст»-2022/2023.

Партнер номинации — компания «Хеликон»: — один из ведущих российских поставщиков продукции и услуг для молекулярно-биологических и клеточных лабораторий.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Что было известно раньше?

У человека и животных (как, например, у хомяка на рис. 1) из арахидоновой кислоты синтезируются эйкозаноиды, или 20-углеродные оксилипины. Это известные медиаторы боли и воспаления, синтез которых является мишенью для обезболивающих и препаратов от бронхиальной астмы. Основную роль играют два пути синтеза, запускаемые ферментами липоксигеназой (LOX) и циклооксигеназой (COX).

Оксилипины человека и других позвоночных участвуют в клеточном диалоге при воспалении (рис. 2): простагландины и лейкотриены — это сигнал «Помогите, меня едят!» (они усиливают воспаление), а липоксины — это сигнал «Тихо!» (они его подавляют). Правда, синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) умеет изящно взламывать эту систему [2]. У нее есть своя, «карманная», липоксигеназа, которую она выделяет при проникновении в ткани хозяина. Эта липоксигеназа окисляет жирные кислоты клеток хозяина с образованием гидропероксидов, которые затем захватываются лейкоцитами и превращаются в липоксины — противовоспалительные соединения, облегчающие бактерии внедрение (рис. 3).

Растения эволюционно ужасно далеки от нас, а их способ быть многоклеточными кардинально отличается от нашего. Но у них тоже есть липоксигеназы — и они тоже участвуют в синтезе оксилипинов, координирующих реакцию на повреждение, например, жасмонатов (рис. 4). Жасмонаты также координируют ответ растения на атаку патогенных бактерий — почти как человеческие оксилипины! Даром что у растений клетки неподвижные и нет воспаления. В общем, растительные жасмонаты — это тоже крик клетки: «Помогите! Меня едят!» (рис. 5).

Однако не все многоклеточные эукариоты используют оксилипины как иммунные сигналы — например, у бурых и диатомовых водорослей это феромоны(рис. 6). Но, так или иначе, они используются почти всеми многоклеточными эукариотами как межклеточные сигналы. Причем почти во всех случаях они синтезируются при помощи липоксигеназы. Возник закономерный вопрос: а что там с бактериями?

Экспериментальные данные по оксилипиновой сигнализации бактерий (за исключением синегнойной палочки) очень скудные. Мы уже проводили биоинформатическое исследование [3], где использовали липоксигеназу как косвенный признак способности синтезировать оксилипины. Оказалось, что ее наличие связано:

• со способностью образовывать многоклеточные структуры — даже самые примитивные, как у нитчатых цианобактерий и миксобактерий; или
• с патогенностью/симбиозом — то есть наличием какого-либо хозяина. Причем хозяин может быть как животным, так и растением — круг хозяев оказался подозрительно широким. 

Особенно хорошо это видно на эволюционной сети всех липоксигеназ: даже если включить туда эукариот, сеть окажется нарезанной на два кусочка, как пирог (рис. 7). Больший кусок связан с многоклеточностью, а вот меньший включает в себя патогенов и симбионтов самых разных организмов — от растений до человека и кораллов. Подробнее о нашем предыдущем исследовании можно прочитать в статье: «По следам оксилипинов: эволюция биохимического “эсперанто”» [4].

Похоже, не только синегнойная палочка пользуется липоксигеназой и оксилипинами для внерения в организм хозяина. Мы решили изучить это подробнее.

Что мы сделали сейчас?

Бактерии с липоксигеназой на первый взгляд (судя по прошлому исследованию) склонны колонизировать растения или поражать пациентов с ослабленным иммунитетом. А некоторые из них ассоциированы с кораллами. Но насколько пересекаются эти экологические функции?

Чтобы это выяснить, мы взяли список бактерий, у которых есть липоксигеназы (он легко создается обычным поиском по BLAST). Далее для каждой бактерии взяли топ-10 статей из PubMed про нее и выписали из аннотаций и заголовков термины, описывающие ее экологию — например, колонизируемый орган («легкие», «кишечник», «корни», «листья») или организм и какие-то другие отличительные признаки. Дальше мы построили граф из этих терминов, где каждый узел — это термин, а каждое ребро — встречаемость двух терминов в статьях про один и тот же вид (рис. 8).

На графе мы покрасили все термины, касающиеся поражения человека («легкие», «сепсис», «пневмония»); все термины про растения («листья», «ризосфера»); все термины «водной» группы (напр., «аквакультура»); и единственный термин, касающийся насекомых (собственно, «насекомое»). Самое страшное, что есть в этой работе — термины, указывающие на опасность для здравоохранения («вновь возникающий патоген», «антибиотикорезистентность»). Кстати, эти «желтые» термины оказываются в самом центре сети — почему-то для бактерий с липоксигеназой характерно примерять на себя роль новых патогенов и быть устойчивыми к антибиотикам.

Но самое интересное — «растительная» группа оказалась тесно связана с «человеческой». Это означает, что бактерии с липоксигеназой — в некотором роде универсалы: они поражают и растения, и человека. А вот «водная» группа терминов находится «на отшибе».

Это означает, что бактерии с липоксигеназой легко «перепрыгивают» между растениями, человеком (и другими позвоночными) и насекомыми, являясь своего рода экологическими универсалами. Но вот перескоков на морские организмы практически нет — у них свои бактерии с липоксигеназой (рис. 9).

Мы также с помощью компьютерных программ построили эволюционные деревья липоксигеназ бактерий. Каждый «листочек» дерева представлял собой одну липоксигеназу. Эволюция липоксигеназ вообще не соответствовала эволюции самих бактерий: на дереве могли соседствовать липоксигеназы, принадлежащие весьма дальним «родственникам», которые даже имеют разный внешний облик! Это явно указывает на многочисленные горизонтальные переносы гена липоксигеназы между разными бактериями (рис. 10).

Гораздо интереснее то, что такие переносы происходили между определенными экологическими группами бактерий: 1) оппортунистическими патогенами человека; 2) патогенами позвоночных; 3) патогенами и симбионтами растений. Причем, судя по дереву, было несколько независимых серий таких переносов — на дереве они выглядят как сходные кластеры в разных его частях. Я нарисовал это схематично для лучшего понимания. Видимо, эволюционно липоксигеназы связаны вовсе не с самими видами, а с взаимоотношениями между ними и их хозяевами.

А значит, они могут быть как-то задействованы в отношениях «хозяин — микроб».

Липоксигеназы бактерий, связанных с морскими обитателями (кораллами, червями-сипункулидами, иглокожими, рыбами и водорослями) тоже образовывали кластеры на наших деревьях. Но они находились далеко от кластеров, образуемых патогенами человека и симбионтами растений (рис. 11) — то есть горизонтального переноса генов липоксигеназ «из моря на сушу» (и обратно) практически не наблюдалось.

В то время как бактерии, колонизирующие растения, насекомых и позвоночных, щедро делились друг с другом липоксигеназами, бактерии морских обитателей со своими липоксигеназами держались особняком (рис. 12). Эта картина очень согласуется с той, которую мы видели в графовом анализе. Это еще раз подтверждает, что липоксигеназы бактерий как-то замешаны во взаимоотношениях с хозяевами. Но как именно?

Странная несовместимость «морских» и «человеческих» / «растительных» липоксигеназ может пролить свет на эту загадку.

Липоксигеназа окисляет жирную кислоту с помощью иона железа, перед этим расположив нужный атом жирной кислоты напротив этого металла (на рис. 13 и 14 — бледно-оранжевый). «Карман» липоксигеназы, в который заходит жирная кислота для окисления, имеет форму длинного изогнутого канала с дном, образованным тремя аминокислотными остатками (на рисунке — фиолетовые).

Чем они больше (чем выше их суммарный объем), тем меньше глубина проникновения жирной кислоты в связывающий участок (рис. 14). А от нее, в свою очередь, зависит место на молекуле кислоты, которое окажется напротив каталитического иона железа и подвергнется окислению — и, как следствие, позиция, в которую присоединится гидроксильная группа.

Суммарный объем остатков, образующих «дно» связывающего участка, можно посчитать по аминокислотной последовательности белка, выровняв его с близкородственной липоксигеназой, для которой известно строение «дна». Например, с той, которая изображена на рис. 13. А значит, можно выяснить, отличаются ли как-нибудь липоксигеназы из «растительной», «позвоночной» и «морской» группы по своими биохимическим особенностям, имея только их последовательности.

Если вкратце, ответ — «отличаются». Липоксигеназы бактерий, связанных с растениями или человеком, имеют близкие значения объема «дна» связывающего участка (рис. 15). Они соответствуют окислению жирной кислоты в 6-м положении с «хвоста», что записывается как ω-6. А вот липоксигеназы бактерий, колонизирующих морских обитателей, имеют меньшие объемы «дна», так что у них другая активность (возможно, ω-12, но точно пока нельзя сказать).

Получается, чтобы перепрыгивать с растений на человека и обратно, нужно иметь липоксигеназу с (ω-6) активностью. (И, скорее всего, окисляющую в S-конфигурации — это мы тоже предположили по аминокислотным остаткам в некоторых позициях и по экспериментально охарактеризованным липоксигеназам из наших кластеров.)

В организме позвоночных и человека такая липоксигеназа будет запускать биосинтез липоксинов. Они будут подавлять иммунный ответ и облегчать инвазию, что показано в экспериментах с синегнойной палочкой — обладателем такой липоксигеназы [2]. Но что происходит при колонизации растений? А в организме растений такая липоксигеназа запустит синтез жасмонатов (рис. 16).

Это известный трюк некоторых бактерий и грибов — выделять при внедрении в ткани растения аналоги жасмонатов (рис. 17). В чрезмерных дозах они подавляют защиту растения, запуская желательные для возбудителя реакции — такие, как смерть клеток. Могут ли бактериальные липоксигеназы задействоваться в достижении подобного эффекта — только за счет синтеза натуральных жасмонатов? Мы предполагаем, что дело обстоит именно так.

Тогда получается, что (ω-6)S-липоксигеназы могут обеспечивать бактериям возможность поражать и позвоночных, и растения, так как совместимы с оксилипиновой сигнализацией обеих групп: и у позвоночных, и у растений из (ω-6)S-гидропероксидов ПНЖК образуются соединения, подавляющие иммунную защиту в высокой дозе. У растений это жасмонаты, а у позвоночных липоксины (рис. 18). Вот такой возможный механизм универсальной патогенности.

И что теперь делать?

Насчет механизма мы, конечно, можем ошибаться, но проанализированные нами данные позволяют более детально нарисовать «портрет» бактерий с липоксигеназой. Например, при колонизации растений они явно предпочитают корни и могут стимулировать рост (рис. 19). Возможно, агробиологам стоит присмотреться к ним повнимательнее.

Еще более зловещий образ имеют те бактерии с липоксигеназой, которые поражают человека (рис. 20). Это патогены, но исключительно оппортунистические — они любят вызывать внутрибольничные инфекции, пневмонию у ослабленных пациентов и особо склонны поражать больных муковисцидозом [6]. Это явно повод использовать липоксигеназы как маркер для молекулярной эпидемиологии и как мишень для новых антибиотиков. По второму направлению мы сейчас пытаемся найти коллег для совместного проекта — есть новые идеи. Stay tuned!

Литература

1. Georgy Kurakin Bacterial lipoxygenases are associated with host-microbe interactions and may provide cross-kingdom host jumps — Cold Spring Harbor Laboratory;
2. Eric Morello, Teresa Pérez-Berezo, Chloé Boisseau, Thomas Baranek, Antoine Guillon, et. al.. (2019). Pseudomonas aeruginosa Lipoxygenase LoxA Contributes to Lung Infection by Altering the Host Immune Lipid Signaling. Front. Microbiol.. 10;
3. G. F. Kurakin, A. M. Samoukina, N. A. Potapova. (2020). Bacterial and Protozoan Lipoxygenases Could be Involved in Cell-to-Cell Signaling and Immune Response Suppression. Biochemistry Moscow. 85, 1048-1063;
4. По следам оксилипинов: эволюция биохимического «эсперанто»;
5. Andrea Chini, Alessio Cimmino, Marco Masi, Pierluigi Reveglia, Paola Nocera, et. al.. (2018). The fungal phytotoxin lasiojasmonate A activates the plant jasmonic acid pathway. Journal of Experimental Botany. 69, 3095-3102;
6. Муковисцидоз — первые надежды.