Конкурс «Био/Мол/Текст»-2015

Эта работа опубликована в номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» конкурса «био/мол/текст»-2015.

---

Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.

---

Спонсоры конкурса: лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Эта работа опубликована в номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» конкурса «био/мол/текст»-2015.

Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.

Спонсоры конкурса: лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Долгое время болезненность выделения стволовых клеток из человеческого организма и отсутствие качественных методов их размножения в культуре сдерживали прорыв в клеточной терапии. Однако не так давно миру была представлена революционная технология перепрограммирования соматических клеток в омоложенные стволовые, называемые индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК). Главные ее возможности — «размножение» стволовых клеток и превращение их в различные специализированные клетки, да к тому же попутно (при необходимости) осуществление генной терапии для исправления мутантных генов [1].

Более того, оказалось, что с помощью перепрограммирования в ИПСК можно получать из клеток старых и даже суперстарых (столетних) пациентов полностью обновленные стволовые клетки, способные дифференцироваться в молодые соматические клетки [2]. Поэтому технологию получения ИПСК следует рассматривать еще и как способ радикального омоложения [3]. Предполагается, что с помощью этих клеток можно будет бороться с заболеваниями, ранее считавшимися неизлечимыми [4]. Так, например, полученные из ИПСК омоложенные клетки мезенхимы можно будет применять для лечения сердца, почек, нервной ткани, суставов, для регенерации костей и терапии воспалительных заболеваний, а также для подавления реакции отторжения при трансплантации [5], поскольку они мало чем отличаются от стволовых клеток из ткани костного мозга [6].

Несмотря на эти и множество других свидетельств благоприятного (лечебного) воздействия клеток, полученных из ИПСК, в клинике они пока не взяты «на вооружение», так как для их использования в терапевтических целях есть серьезные препятствия — опасность формирования опухолей и иммуногенность плюрипотентных клеток [7]. Инъекция пациенту его же собственных ИПСК обычно приводит к иммунной реакции, препятствующей их приживлению, или даже к образованию опухолей типа тератомы. Такая способность ИПСК образовывать опухоли связана со сбоем механизма эпигенетической перестройки, а не с необратимыми генетическими мутациями [8], и может быть предсказана по активации определенных сигнальных путей [9].

Этот онкогенный и иммуногенный потенциал, как выяснилось, обычно обусловлен присутствием недифференцированных ИПСК. Поэтому перед использованием этих клеток в терапии важно не только провести полную дифференцировку всех ИПСК, но и тщательно очистить материал, предназначенный для трансплантации, от плюрипотентных клеток [10], [11]. Было разработано множество методов подобной очистки, значительно снижающих риск образования опухоли [12], [13]. Тем не менее даже самая изощренная предварительная очистка не способна обезопасить подсадку материала, полученного из ИПСК, так как после избирательного удаления плюрипотентных клеток они могут появиться вновь путем превращения дифференцированных клеток обратно в стволовые (к чему может подтолкнуть, например, гипоксия) [14], [15]. И из-за этого снова возникает риск образования опухоли. Обычно такие опухоли обнаруживают не сразу, а только при длительном наблюдении [16].

Поскольку причиной таких спонтанных переходов может быть геномная нестабильность полученных ИПСК, важно снизить в них уровень повреждений ДНК и количество геномных перестроек, ограничив вызываемый перепрограммированием репликативный стресс — например, за счет повышения уровня чекпоинт-киназы 1 (CHK1) и добавления в среду для перепрограммирования свободных нуклеозидов [17].

Чтобы защитить организм от риска, связанного с возможностью образования опухолей при клеточной терапии с использованием ИПСК или полученных из них дифференцированных клеток, необходим аварийный предохранитель, позволяющий с большой надежностью избавляться от этих клеток, если что-то пошло не так.

Таким предохранителем мог бы быть избирательный апоптоз всех клеток, полученных из ИПСК, — такой, при котором остальные клетки организма не испытывали бы сильную интоксикацию.

С этой целью была создана система активации апоптоза на базе гена тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (ВПГ) и довольно токсичного и мутагенного препарата ганцикловира, аналога гуанина. При воздействии ТК-ВПГ ганцикловир фосфорилируется в монофосфат, который клеточные киназы затем превращают в трифосфат. Последний ингибирует синтез ДНК, конкурентно подавляя ДНК-полимеразу. Особенностью этой системы является то, что апоптоз наблюдается только в делящихся клетках. Чтобы апоптоз затрагивал не все делящиеся клетки, а лишь плюрипотентные, с характерными только для них регуляторами транскрипции, в качестве промотора для гена ТК-ВПГ используют промоторы генов транскрипционных факторов Oct-4 [18] или Nanog [19]. Опухоли, образующиеся из таких модифицированных плюрипотентных стволовых клеток, можно ингибировать введением ганцикловира. Однако недостатком такой системы является то, что она позволяет выжить медленно делящимся клеткам, из-за чего лечение токсичным и мутагенным препаратом приходится растягивать на длительное время [20], а это снижает шансы на успешное лечение.

В качестве альтернативы была разработана другая система активации апоптоза. Чтобы сделать применение ИПСК в клинике безопасным, было предложено одновременно с перепрограммированием клеток пациента вводить в них на той же кассете, что и перепрограммирующие факторы, ген индуцируемой каспазы 9 (iCasp9). Генно-инженерная каспаза 9 активируется препаратом (AP1903 или AP20187), вызывающим димеризацию ее молекул. В результате в 94–99% клеток, содержащих iCasp9, начинается апоптоз [21], приводящий к гибели этих клеток (рис. 1).

Методика была первоначально разработана для быстрого удаления терапевтических аллогенных Т-клеток в случае развития у пациента реакции «трансплантат против хозяина» во время лечения лейкемии [22]. Она позволила применять существенно более высокие концентрации Т-клеток, не опасаясь за последствия: однократной инъекции индуктора димеризации было достаточно, чтобы за полчаса разрушить клетки, содержащие ген iCasp9.

Помимо быстроты излечения, важным преимуществом этой системы является низкая токсичность димеризующего препарата, а также то, что он (в случае AP1903) не используется в какой-либо иной терапии или в пищевых продуктах. По предварительным данным, введение гена iCasp9 в ИПСК никак не отражалось на их плюрипотентности: сохранялась способность и к пролиферации, и к дифференцировке в клетки всех трех зародышевых листков.

Поскольку удаление клеток с помощью индуцируемого апоптоза всё же не было 100-процентным — возможно, из-за активации антиапоптозных белков вроде Bcl-2 [23] — необходимо дальнейшее совершенствование системы аварийной безопасности ИПСК, основанной на суицидных генах. Это позволит приблизить время, когда омоложенные стволовые клетки можно будет широко применять для лечения людей.

Литература

1. Нобелевская премия по физиологии и медицине (2012): индуцированные стволовые клетки;
2. Ollivier Milhavet, Jean-Marc Lemaitre. (2014). Senescent-Derived Pluripotent Stem Cells Are Able to Redifferentiate into Fully Rejuvenated Cells. Tumor Dormancy, Quiescence, and Senescence, Volume 2. 265-276;
3. Французским исследователям удалось омолодить клетки столетних людей;
4. H. Inoue, N. Nagata, H. Kurokawa, S. Yamanaka. (2014). iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33, 409-417;
5. Joana Frobel, Hatim Hemeda, Michael Lenz, Giulio Abagnale, Sylvia Joussen, et. al.. (2014). Epigenetic Rejuvenation of Mesenchymal Stromal Cells Derived from Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 3, 414-422;
6. Solvig Diederichs, Rocky S. Tuan. (2014). Functional Comparison of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Mesenchymal Cells and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells from the Same Donor. Stem Cells and Development. 23, 1594-1610;
7. Evgenios Neofytou, Connor Galen O’Brien, Larry A. Couture, Joseph C. Wu. (2015). Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. J. Clin. Invest.. 125, 2551-2557;
8. Kotaro Ohnishi, Katsunori Semi, Takuya Yamamoto, Masahito Shimizu, Akito Tanaka, et. al.. (2014). Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156, 663-677;
9. Eugene Makarev, Kristen Fortney, Maria Litovchenko, Karl H. Braunewell, Alex Zhavoronkov, Anthony Atala. (2015). Quantifying signaling pathway activation to monitor the quality of induced pluripotent stem cells. Oncotarget. 6, 23204-23212;
10. Shigeo Masuda, Shigeru Miyagawa, Satsuki Fukushima, Nagako Sougawa, Kaori Okimoto, et. al.. (2015). Eliminating residual iPS cells for safety in clinical application. Protein Cell. 6, 469-471;
11. Gonçalo M. C. Rodrigues, Carlos A. V. Rodrigues, Tiago G. Fernandes, Maria Margarida Diogo, Joaquim M. S. Cabral. (2015). Clinical-scale purification of pluripotent stem cell derivatives for cell-based therapies. Biotechnology Journal. 10, 1103-1114;
12. Hiroaki Tateno, Yasuko Onuma, Yuzuru Ito, Fumi Minoshima, Sayoko Saito, et. al.. (2015). Elimination of Tumorigenic Human Pluripotent Stem Cells by a Recombinant Lectin-Toxin Fusion Protein. Stem Cell Reports. 4, 811-820;
13. Marek Malecki. (2014). ‘Above all, do no harm’: safeguarding pluripotent stem cell therapy against iatrogenic tumorigenesis. Stem Cell Res Ther. 5;
14. Tsutomu Kumazaki, Tomoko Takahashi, Taira Matsuo, Mizuna Kamada, Youji Mitsui. (2013). Reemergence of undifferentiated cells from transplants of human induced pluripotent stem cells is a possible potential risk factor of tumorigenic differentiation. Cell Biol Int Rep. n/a-n/a;
15. Mizuna Kamada, Youji Mitsui, Taira Matsuo, Tomoko Takahashi. (2016). Reversible transformation and de-differentiation of human cells derived from induced pluripotent stem cell teratomas. Human Cell. 29, 1-9;
16. Satoshi Nori, Yohei Okada, Soraya Nishimura, Takashi Sasaki, Go Itakura, et. al.. (2015). Long-Term Safety Issues of iPSC-Based Cell Therapy in a Spinal Cord Injury Model: Oncogenic Transformation with Epithelial-Mesenchymal Transition. Stem Cell Reports. 4, 360-373;
17. Sergio Ruiz, Andres J. Lopez-Contreras, Mathieu Gabut, Rosa M. Marion, Paula Gutierrez-Martinez, et. al.. (2015). Limiting replication stress during somatic cell reprogramming reduces genomic instability in induced pluripotent stem cells. Nat Commun. 6;
18. Akira Hara, Hitomi Aoki, Ayako Taguchi, Masayuki Niwa, Yasuhiro Yamada, et. al.. (2008). Neuron-like Differentiation and Selective Ablation of Undifferentiated Embryonic Stem Cells Containing Suicide Gene with Oct-4 Promoter. Stem Cells and Development. 17, 619-628;
19. Zhili Rong, Xuemei Fu, Meiyan Wang, Yang Xu. (2012). A Scalable Approach to Prevent Teratoma Formation of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Biological Chemistry. 287, 32338-32345;
20. Ortwin Naujok, Joanna Kaldrack, Terbish Taivankhuu, Anne Jörns, Sigurd Lenzen. (2010). Selective Removal of Undifferentiated Embryonic Stem Cells from Differentiation Cultures Through HSV1 Thymidine Kinase and Ganciclovir Treatment. Stem Cell Rev and Rep. 6, 450-461;
21. Shigeki Yagyu, Valentina Hoyos, Francesca Del Bufalo, Malcolm K Brenner. (2015). An Inducible Caspase-9 Suicide Gene to Improve the Safety of Therapy Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Molecular Therapy. 23, 1475-1485;
22. Antonio Di Stasi, Siok-Keen Tey, Gianpietro Dotti, Yuriko Fujita, Alana Kennedy-Nasser, et. al.. (2011). Inducible Apoptosis as a Safety Switch for Adoptive Cell Therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683;
23. Cecilia N. Barese, Tania C. Felizardo, Stephanie E. Sellers, Keyvan Keyvanfar, Antonio Di Stasi, et. al.. (2015). Regulated Apoptosis of Genetically Modified Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Via an Inducible Caspase-9 Suicide Gene in Rhesus Macaques. Stem Cells. 33, 91-100;
24. Karin C. Straathof, Martin A. Pulè, Patricia Yotnda, Gianpietro Dotti, Elio F. Vanin, et. al.. (2005). An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105, 4247-4254.