В последнее время как в российских, так и в зарубежных СМИ появляются сообщения о «чудо-фруктах», «чудо-овощах» и «чудо-цветах» с необычной окраской, которая либо не встречается у данных видов растений, либо встречается, но очень редко. Так, например, немалый фурор среди российской общественности произвела новость о создании уральскими селекционерами сорта картофеля «Чудесник» с фиолетовой окраской мякоти (рис. 1, слева).

И хотя на российском рынке фиолетовая морковь и перец являются чем-то необычным и очень редким, за рубежом овощами с фиолетовой окраской уже никого не удивить (рис. 1, в центре). Среди «чудес» науки, которые поражают воображение многих людей, можно упомянуть голубые розы (рис. 1, справа), впервые созданные в 2004 году австралийской компанией Флориген (Florigene) при поддержке японского холдинга Сантори.

Приведенные примеры растений с необычной для нас окраской различных органов объединяет то, что все они были искусственно созданы человеком с помощью манипуляций с окраской, которая обусловлена растительными пигментами — антоцианами. Однако без всестороннего исследования природы антоциановой окраски и генетической составляющей биосинтеза антоциановых соединений манипуляция с окраской у различных видов растений была бы невозможна.

Что такое антоцианы? Несколько слов о химии

На сегодняшний день достаточно хорошо исследованы такие растительные пигменты, как флавоноиды, каротиноиды и беталаины; они имеют различную химическую структуру и придают растениям различную окраску. И хотя каротиноиды и беталаины тоже очень интересные пигменты, в данной статье мне бы хотелось остановиться на пигментах флавоноидной природы, поскольку именно они обусловливают огромное разнообразие оттенков цветов у растений. К данной группе относятся повсеместно распространенные среди цветковых растений антоцианы, которые не только окрашивают растения в розовые, красные, оранжевые, алые, пурпурные, голубые, темно-синие цвета, но и являются очень полезными для человека биологически активными молекулами [1]. И хотя другие флавоноидные соединения также могут участвовать в образовании цвета у растений (например, ауроны обеспечивают желтую окраску, а бесцветные флавонолы стабилизируют антоциановые пигменты), основное внимание в статье будет уделено именно антоцианам.

Итак, антоцианы — это растительные пигменты, которые могут присутствовать у растений в генеративных (цветках, пыльце) и вегетативных (стеблях, листьях, корнях) органах, а также в плодах и семенах [2]. При этом данные соединения могут либо постоянно присутствовать в клетке, либо появляться на некоторое время на определенной стадии развития растений или при действии стресса. Последнее обстоятельство навело ученых на мысль, что данные соединения нужны не только для окраски цветов и плодов для привлечения насекомых-опылителей и распространителей семян, но и для борьбы с различными типами стрессов [3].

Первые опыты по изучению антоциановых соединений и их химической природы были проведены известным английским химиком Робертом Бойлем еще в 1664 г., когда он впервые обнаружил, что под действием кислот синий цвет лепестков василька изменялся на красный, под действием же щелочи лепестки зеленели [4]. В 1913–1915 гг. немецкие биохимики Р. Вильштеттер и А. Штоль опубликовали серию работ, проливших свет на вопрос о сущности природной окраски антоцианов. Из цветков различных растений они выделили индивидуальные пигменты и описали их химическое строение. Оказалось, что антоцианы в клетках находятся преимущественно в виде гликозидов. Их агликоны (базовые молекулы-предшественники), получившие название антоцианидинов, связаны преимущественно с сахарами глюкозой, галактозой, рамнозой [4].

Все антоцианы (которых известно более 500, и число это растет [5]) имеют общий С₁₅-углеродный скелет, образованный двумя бензольными кольцами А и В, соединенными С₃-фрагментом. При этом от других флавоноидных соединений антоцианы отличаются наличием положительного заряда и двойной связи в С-кольце (рис. 2). Несмотря на огромное разнообразие антоциановых соединений, все они представляют собой производные шести основных антоцианидинов: пеларгонидина, цианидина, пеонидина, дельфинидина, петунидина и мальвидина, которые отличаются боковыми радикалами R₁ и R₂ (рис. 2, табл. 1). Поскольку при биосинтезе (о нем речь пойдет чуть ниже) пеонидин образуется из цианидина, а петунидин и мальвидин — из дельфинидина, можно выделить три основных антоцианидина: пеларгонидин, цианидин и дельфинидин, которые, таким образом, являются предшественниками всех антоциановых соединений.

Имея общее строение С₁₅-углеродного скелета, индивидуальные соединения в классе антоцианов выделяют на основе наличия, положения и характера модификаций основного С₁₅-углеродного скелета. В качестве примера строения индивидуального соединения антоциана с модификациями А-, В- и С-колец на рисунке 3 приведена структура так называемого «небесно-синего антоциана», который придает растениям ипомеи голубую окраску.

Какую именно окраску будет иметь растение, зависит от многих факторов:

• структуры и концентрации антоцианов (которая, кстати, зависит и от наличия стресса — засухи, интенсивного освещения, холода),
• pH в вакуолях, где они накапливаются (см. выше описание опытов Роберта Бойля),
• наличия ко-пигментов, стабилизирующих антоциановую окраску, а также
• ионов металлов (алюминия, железа, магния, молибдена, вольфрама), с которыми антоцианы могут образовывать комплексы, меняя свой цвет на голубой. В этом случае очень показательным является пример образования комплекса антоцианов корня горчицы с ионами молибдена (рис. 4).
• Немаловажное значение также имеет локализация этих соединений в тканях растений.

Существует такая закономерность: голубой (синий) цвет имеет дельфинидин и его производные, красно-оранжевую окраску имеют производные пеларгонидина, а пурпурно-красную — цианидина. При этом голубой цвет обусловливают гидроксильные группы (табл. 1, рис. 3), метилирование которых (присоединение группы —CH₃) приводит к «покраснению» [7]. Однако следует учитывать, что одно и то же антоциановое соединение в зависимости от сдвига в величине кислотности клеточного сока может приобретать различные оттенки. Так, раствор антоцианов в кислой среде имеет красный, в нейтральной — пурпурный, а в щелочной — желто-зелёный цвет (рис. 5).

Итак, чем обусловлены оттенки антоциановой пигментации, почему они разные у разных видов растений, или даже у одних и тех же растений в разных условиях произрастания, становится ясно. Вооружившись уже изложенными данными, каждый читатель может сам поэкспериментировать со своими домашними растениями, понаблюдав за изменением их окраски. Однако, если в ходе этих экспериментов вы добьетесь желаемого оттенка цвета и ваше растение выживет, то уже точно оно не передаст данный оттенок своим потомкам. Чтобы эффект был стойким, необходимо разобраться еще в одном аспекте формирования цвета, а именно в генетической составляющей биосинтеза антоцианов в клетках растений.

Молекулярно-генетические основы биосинтеза антоцианов

Данный вопрос исследован на сегодняшний день достаточно полно, чему немало поспособствовали мутанты различных видов растений с нарушенным биосинтезом антоцианов. Было установлено, что на биосинтез антоцианов (а, следовательно, и на формируемый оттенок у растения) влияют мутации в трех типах генов [8]:

1. кодирующих ферменты, участвующие в цепи биохимических превращений (структурные гены),
2. определяющих транскрипцию структурных генов в нужное время в нужном месте (регуляторные гены) и
3. кодирующих транспортеры антоцианов в вакуоли (известно, что антоцианы, находящиеся в цитоплазме, окисляются и формируют агрегаты бронзового цвета, которые являются очень токсичными для клеток растений [9]).

Благодаря методам биохимии и молекулярной генетики все стадии биосинтеза антоцианов и осуществляющие их ферменты на сегодняшний день известны и достаточно полно исследованы (рис. 6), в том числе из многих видов растений выделены структурные и регуляторные гены биосинтеза антоцианов [8]. Знание особенностей биосинтеза антоциановых пигментов у конкретного вида растения позволяет проводить манипуляции с его окраской на генетическом уровне, создавая растения с необычной пигментацией, которые будут передавать новые признаки окраски из поколения в поколение.

Подходы и «горячие точки» для модификации цвета у растений

В связи с вышеизложенным «горячими точками» для модификации цвета у растений в основном являются структурные и регуляторные гены. Гены, кодирующие транспортеры, также используются для изменения цвета, но не так часто, как две другие группы генов.

Подходы, с помощью которых можно модифицировать окраску растений, делятся на два типа. К первому типу относятся подходы на основе методов селекции, позволяющие ввести гены от доноров — растений близкородственного вида, имеющих нужный признак. По славам авторов «Чудесника», именно методом селекции был создан этот сорт (рис. 1, слева). Ещё один яркий пример — это пшеница с пурпурным и голубым цветом зерна, обусловленным антоцианами (рис. 7).

В дикой природе пшеница с пурпурным зерном впервые была обнаружена в Эфиопии (где, по всей видимости, и появился данный признак), а потом гены, которые обусловливают этот признак, были введены методами селекции в возделываемые сорта мягкой пшеницы [10]. Пшеница с голубым зерном в природе не встречается, но зато голубое зерно имеет родственник пшеницы — пырей. Скрещивая пырей и пшеницу и ведя отбор по данному признаку, селекционеры получили пшеницу с голубым зерном, как у пырея [10]. В вышеназванных примерах в геном пшеницы были введены регуляторные гены. То есть, пшеница и так имеет функциональный аппарат биосинтеза антоцианов (все ферменты необходимые для биосинтеза в порядке), а, вводя методами селекции регуляторные гены от родственных видов, у пшеницы запускают машину биосинтеза антоцианов именно в зерне.

Схожий пример, но уже с использованием второй группы методов манипуляции с окраской — методов генетической инженерии: были получены томаты с повышенным содержанием антоцианов [11]. В норме спелые томаты содержат каротиноиды, в том числе жирорастворимый антиоксидант ликопин; из флавоноидов в них есть небольшое количество нарингенина халкона (2’,4’,6’,4-тетрагидроксихалкон, см. рис. 6) и рутина (гликозированный 5,7,3’,4’-тетрагидрооксифлавонол). Вводя в растения томата генетическую конструкцию, содержащую регуляторные гены биосинтеза антоцианов львиного зева Ros1 и Del под управлением промотора E8, активного в плодах томата, авторам удалось получить томаты с высоким содержанием антоцианов (рис. 8). Таким образом, запустить «машину» биосинтеза антоцианов в определенной ткани можно посредством манипуляции с регуляторными генами, которую проводят либо методами селекции, либо методами генетической инженерии.

Пример использование генетической инженерии, для манипуляций с окраской за счет структурных генов биосинтеза антоцианов — пионерская работа, проведенная на петунии [12]. В этой работе впервые в истории были применены методы генетической инженерии с целью изменения окраски растений. В норме растения петунии вовсе не содержат пигментов, производных от пеларгонидина (рис. 6). Это связано с тем, что для фермента DFR (дигидрофлавонол 4-редуктазы) петунии самым предпочтительным субстратом является дигидромирицетин, менее предпочтительным — дигидрокверцетин, а дигидрокемпферол вовсе не используется в качестве субстрата (рис. 6).

Совершенно другая картина субстратной специфичности фермента DFR наблюдается у кукурузы, DFR которой предпочтительнее использует дигидрокемпферол в качестве субстрата [13]. Вооружившись этими знаниями, Мейер с коллегами использовали мутантную линию петунии, у которой отсутствовали функциональные ферменты F3’Н и F3’5’H. Глядя на рисунок 6, нетрудно заметить, что данная мутантная линия накапливала дигидрокемпферол, который не является субстратом для DFR петунии, но зато является субстратом для DFR кукурузы. Введя в мутантную линию генетическую конструкцию, содержащую ген Dfr кукурузы, Мейер получил петунию с несвойственной для неё кирпично-красной окраской цветков (рис. 9).

Однако не всегда у исследователей под руками есть такие удобные мутанты с отсутствием какой-либо ферментативной активности, поэтому наиболее часто при модификации окраски растений приходится её «выключать» и «включать» другую, требуемую активность. Именно такой подход был реализован при создании первой в мире розы с синей окраской бутонов (рис. 1, справа), схема создания которой приведена на рисунке 10.

У роз, созданных усилиями селекционеров, окраска лепестков варьирует от ярко-красных и нежно-розовых до жёлтых и белоснежных. Интенсивное изучение биосинтеза антоцианов у роз позволило установить, что они не имеют F3’5’H-активности, а фермент DFR розы использует в качестве субстратов дигидрокверцетин и дигидрокемпферол, но не дигидромирицетин (рис. 6). Поэтому при создании синей розы учёные выбрали следующую стратегию.

1. Сначала «отключали» собственный фермент DFR (для этого применялся подход, основанный на РНК-интерференции).
2. Затем в геном розы был введен ген, кодирующий функциональный F3’5’H анютиных глазок.
3. После этого в геном был введен ген Dfr ириса, который кодирует фермент с дигидромирицетин-субстратной специфичностью, производящий дельфинидин — предшественник антоцианов с синей окраской.

При этом, чтобы F3’5’H анютиных глазок и F3’H розы не конкурировали друг с другом за субстрат (оба фермента используют в качестве субстрата дигидрокемпферол, рис. 6), для создания синей розы был выбран доступный генотип с отсутствием F3’H активности.

Еще одни яркий пример использования накопленных данных о биосинтезе флавоноидных пигментов с целью создания растений с несвойственной для них окраской — это получение методами генетической инженерии растений торении с жёлтой окраской цветков (рис. 11).

Известно, что жёлтую окраску имеют два типа пигментов: ауроны (класс пигментов флавоноидной природы, которые обусловливают яркую жёлтую окраску цветков львиного зева и георгин), и каротиноиды (пигменты цветков томатов и тюльпанов). В ходе анализа биосинтеза ауронов у львиного зева было установлено, что данные пигменты синтезируются из халконов посредством двух ферментов — 4’CGT (4’-халконгликозилтрансферазы) и AS (ауреузидинсинтазы) (рис. 11). Введение генетических конструкций с генами 4’Cgt и As львиного зева в растения торении, в норме имеющие синюю окраску цветков, совместно с ингибированием биосинтеза антоциановых пигментов привело к накоплению ауровнов и, следовательно, к яркой жёлтой окраске цветков (рис. 11). (Читатель самостоятельно может предположить, на уровне работы каких ферментов может быть заблокирован биосинтез антоцианов в этом случае.) Разработанная специалистами стратегия может быть использована для получения желтой окраски цветков не только у торении, но и у герани и фиалки [14].

Приведенные примеры — это лишь малая доля того, какие манипуляции ученые проводят с тем, что им очень хорошо известно — с биосинтезом антоцианов.

Заключение

Как видно, огромному успеху в манипуляции с окраской у растений способствует интенсивное исследование биохимической природы пигментов, а также особенностей их биосинтеза у различных видов растений — как на уровне ферментов, так и на молекулярно-генетическом уровне. Накопленный к настоящему времени багаж знаний об антоциановых соединениях открыл неисчерпаемые возможности для создания декоративных растений с необычной окраской, а также культурных видов растений с повышенным содержанием антоциановых пигментов. И хотя достижения селекции — необычно окрашенные овощи и фрукты — уже сейчас доступны покупателям в ряде стран, декоративные растения, созданные методами генетической инженерии, в большинстве своем на рынке являются ещё достаточно редкими. Дело в том, что из-за ряда нерешенных трудностей — таких, например, как стабильность наследования модифицированной окраски, — они ещё не коммерциализированы (за исключением некоторых сортов петунии, синей розы, лиловой гвоздики). Однако работа в этом направлении продолжается. Будем надеяться, что в скором времени появятся радующие глаз «чудеса» науки, которые будут доступны всем любителям прекрасного.

Литература

1. Lila A.M. (2004). Anthocyanins and human health: An in vitro investigative approach. J. Biomed. Biotechnol. 5, 306–313;;
2. Wheldale M. The anthocyanin pigments of plants. — Cambridge University Press, 1916. — 320 pp.;
3. Chalker-Scott L. (1999). Environmental significance of anthocyanins in plant stress responses. Photochem. Photobiol. 70, 1–9;;
4. Карабанов И.А. Флавоноиды в мире растений. — Минск: Ураджай, 1981. — с.80;
5. Andersen O.M., Jordheim M. The anthocyanins. // Andersen O.M., Markham K.R. (Eds.). Flavonoids: chemistry, biochemistry and applications. — Boca Raton, FL: CRC Press, 2006. — P. 452–471;
6. Hale K.L., McGrath S.P., Lombi E., Stack S.M., Terry N., Pickering I.J., George G.N., Pilon-Smits E.A.H. (2001). Molybdenum sequestration in Brassica species. A role for anthocyanins? Plant Physiol. 126, 1391–1402;;
7. Tanaka Y., Brugliera F., Chandler S. (2009). Recent progress of flower colour modification by biotechnology. Int. J. Mol. Sci. 10, 5350–5369;;
8. Mol J., Grotewold E., Koes R. (1998). How genes paint flowers and seeds. Trends Plant Sci. 3, 212–217;;
9. Marrs K.A., Alfenito M.R., Lloyd A.M., Walbot V. (1995). A glutathione S-transferase involved in vacuolar transfer encoded by the maize gene Bronze-2. Nature 375, 397–400;;
10. Zeven A.C. (1991). Wheats with purple and blue grains: a review. Euphytica 56, 243–258;;
11. Butelli E., Titta L., Giorgio M., Mock H.P., Matros A., Peterek S., Schijlen E.G., Hall R.D., Bovy A.G., Luo J., Martin C. (2008). Enrichment of tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of select transcription factors. Nat. Biotechnol. 26, 1301–1308;;
12. Meyer P., Heidmann I., Forkmann G., Saedler H. (1987). A new petunia flower colour generated by transformation of a mutant with a maize gene. Nature 330, 677–678;;
13. Forkmann G., Ruhnau B. (1987). Distinct substrate specificity of dihydroflavonol 4-reductase from flowers of Petunia hybrid. Z. Naturforsch 42c, 1146–1148;
14. Ono E., Fukuchi-Mizutani M., Nakamura N., Fukui Y., Yonekura-Sakakibara K., Yamaguchi M., Nakayama T., Tanaka T., Kusumi T., Tanaka Y. (2006). Yellow flowers generated by expression of the aurone biosynthetic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11075–11080..