Конкурс «био/мол/текст»-2013

Эта работа заняла первое место в номинации «Своя работа» конкурса «био/мол/текст»-2013.

---

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

С увеличением средней продолжительности жизни все больше людей страдают от болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона. К сожалению, годы исследований пока не привели ученых к открытию причин развития этих заболеваний и возможной терапии. Это связано, главным образом, с тем, что почти ничего не известно о факторах, вызывающих болезнь, а также с тем, что очень мало пациентов имеют генетическую предрасположенность. Чаще всего эти заболевания являются спорадическими, т.е. причины их возникновения не установлены. Это приводит к бесконечным спорам — никто не знает, как искусственно вызвать это заболевание у модельных животных для экспериментов и поиска лекарств. Поэтому все больше ученых обращают свое внимание на генетические заболевания нервной системы, такие как болезнь Хантингтона (БХ). Это заболевание также, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, относится к группе нейродегенеративных заболеваний, с которыми его объединяет ряд схожих черт: гибель нейронов центральной нервной системы, накопление амилоидоподобных агрегатов белков, когнитивные и двигательные нарушения у больных. При этом БХ имеет важное преимущество с точки зрения исследователей, т.к. известно, какая мутация вызывает это заболевание. Это дает возможность создавать точные генетические модели и исследовать их на животных. Это важно, потому что если мы поймем патогенез болезни Хантингтона, то нам легче будет разобраться и со спорадическими нейродегенеративными заболеваниями. Это мы и попытались сделать в своем исследовании.

Болезнь Хантингтона

Болезнь Хантингтона (БХ, в русскоязычной литературе также «болезнь Гентингтона») — наследственное заболевание нервной системы, которое поражает примерно 1 из 10 тыс. людей. Болезнь была впервые описана Джорджем Хантингтоном (George Huntington) в 1872, и с тех пор носит его имя, однако клинические симптомы этого заболевания были известны еще в XVI веке под названием «хорея» (от лат. choreus — танец). К признакам хореи относили непроизвольные, нескоординированные быстрые движения, похожие на судороги; именно так описывают и современные медики моторные нарушения, характерные для БХ. Болезнь может порой длиться до двадцати лет, но исход неизменно один и тот же: больной теряет способность самостоятельно передвигаться, говорить, а затем и мыслить. Как правило, симптомы болезни Хантингтона проявляются в возрасте от 30 до 50 лет, хотя у 5–10% пациентов отмечается появление симптомов в возрасте до 20 лет — так называемая ювенильная форма заболевания [1].

Первый симптом болезни Хантингтона — непроизвольные подёргивания конечностей, торса и лицевых мышц. Довольно часто они сопровождаются резкими сменами настроения, депрессией, раздражительностью, неразборчивостью речи и неуклюжестью движений. По мере прогрессирования болезни, к этим симптомам добавляются затруднения или боль при глотании, неустойчивость походки, потеря равновесия, нарушение мыслительных функций и ухудшение памяти. В конце концов, больной теряет способность передвигаться без помощи посторонних и умирает обычно от пневмонии, остановки сердца или других осложнений.

Важной для врачей и исследователей особенностью БХ является то, что это заболевание является наследственным и вызывается мутацией в одном-единственном гене. Оказалось, что к развитию БХ приводит увеличение количества повторов триплета CAG, кодирующего глутамин, в первом экзоне гена белка хантингтина. При этом, чем больше количество повторов этого триплета, тем раньше начинается развитие заболевания. В норме в человеческой популяции встречается от 10 до 35 повторов. У пациентов с БХ количество повторов может быть от 36 до 121, при ювенильной форме — от 50 и выше [2]. Благодаря выявлению генетической основы заболевания, диагностика БХ в настоящее время не представляет проблемы; кроме того, возможной стала пренатальная диагностика заболевания и проверка эмбрионов перед имплантацией при ЭКО, которая позволяет иметь здоровых детей даже носителям мутантного гена.

К сожалению, выявление точной мутации все еще не позволяет ученым определить причину развития болезни Хантингтона и найти соответствующее лечение. Появление в клетке мутантного гена и, соответственно, измененного (мутантного) белка может привести к развитию патологии двумя путями: потеря функции (loss-of-function) или приобретение функции (gain-of-functin). В первом случае мутантный белок не может выполнять ту же функцию, что белок нормальный, и это приводит к нарушению клеточных процессов. Во втором случае, мутантный белок мешает нормальной жизнедеятельности клетки, начиная выполнять какую-то «лишнюю функцию». Чтобы разобраться, что происходит при БХ, ученые интенсивно изучают как функцию нормального белка хантингтина, так и поведение его мутантной формы [3].

К сожалению, попытки определить точную клеточную функцию хантингтина пока не увенчались успехом. Различные исследования указывают на участие этого белка в широком спектре биологических процессов, включая транспорт белков и везикул (мембранных пузырьков-транспортеров), организацию цитоскелета, клатрин-опосредованный эндоцитоз, постсинаптический сигналинг, регуляцию транскрипции и анти-апоптотические процессы [4]. Если удастся доказать, что нарушение какой-либо из этих функций является ключевым для развития заболевания, то лекарственные препараты для поддержания этой функции могут спасти пациентов с болезнью Хантингтона.

Если верна гипотеза о приобретении функции, особое внимание стоит обратить на поведение мутантной формы хантингтина. Оказалось, что мутантный белок формирует агрегаты, которые являются одной из характерных черт развития БХ как у людей,так и у модельных животных (см.врезку). Сначала агрегаты были описаны только в ядре, однако последующие работы выявили их также в цитоплазме и отростках нейронов [5]. В последние годы многие авторы склоняются к тому, что образование агрегатов несет скорее протективную функцию, а основной патогенной формой мутантного хантингтина является мономерный растворимый белок [6].

Почему мы решили исследовать параметры синаптической передачи при болезни Хантингтона

Синаптическая передача — это передача сигналов между нейронами с помощью синаптического контакта. При возбуждении одного нейрона его синаптическое окончание выделяет в синаптическую щель медиатор — химическое вещество, которое оказывает свое возбуждающее или тормозящее воздействие на синаптическое окончание второго нейрона (рис. 1). Таким образом, синапсы связывают нейроны между собой, обеспечивая нормальное функционирование нейронных сетей и всей нервной системы. Если какая-то из систем головного мозга перестает функционировать, причина может крыться либо в нарушении работы отдельных нейронов, либо в нарушении связи между ними, т.е. нарушении синаптической передачи.

При болезни Хантингона поражается специфическая область головного мозга, называемая стриатумом. Стриатум является частью важного нейронного пути — экстрапирамидной системы, которая участвует в управлении движением и поддержании мышечного тонуса. Гибель нейронов стриатума при болезни Хантингтона приводит к разрушению экстрапирамидной системы, что связано с потерей контроля над движениями у больного человека. Но когда возникают первые патологические симптомы (тремор, нарушение координации), головной мозг человека еще не поврежден: нейроны начинают погибать только через несколько лет после начала развития заболевания. Т.е. болезнь начинается, когда что-то меняется в работе самих нейронов или в синаптической передаче, и эти нарушения впоследствии ведут к гибели нейронов и необратимым последствиям.

Накопившиеся за последние годы результаты исследований заставляют многих ученых склоняться к мысли, что именно нарушение нормальной работы системы нейрональной связи, синапсов и синаптической передачи, приводит к ранним нарушениям в работе экстрапирамидной системы. Оказалось, что в нейронах с мутациями в гене, кодирующем белок хантингтин, наблюдается целый ряд патологических изменений, которые нарушают синаптическую передачу. В таких мутантных клетках нарушается формирование и обновление запаса везикул (пузырьков с медиатором), изменяется внутриклеточная концентрация кальция , который необходим для нормального высвобождения медиатора в синаптическую щель, снижается количество ряда необходимых для функционирования синапса белков и т.п. [7]. Все это приводит к сниженному выбросу медиатора в синаптическую щель, а если медиатора недостаточно, то нейроны начинают хуже «слышать» друг друга, и команды, посылаемые корой головного мозга, не будут выполняться по всей строгости.

В 2013 году Нобелевской премии по физиологии и медицине удостоены работы, благодаря которым стали ясны детали везикулярного транспорта — процесса образования и транспортировки мембранных пузырьков (везикул) между клетками: «Нобелевская премия по физиологии и медицине (2013): везикулярный транспорт» [8]. — Ред.

Изучение нарушенной синаптической передачи при БХ было темой нашего исследования. Может ли быть, что неправильная работа нейронов стриатума на ранней стадии БХ вызвана тем, что они «не слышат» команды нейронов коры? Может ли ослабление синаптической связи приводить к необратимым изменениям в нейронах стриатума и вести к их гибели? О чем мы узнали во время поиска ответов на эти вопросы, рассказано ниже.

Результаты исследований: изменения в синаптической передаче при болезни Хантингтона

Изучать синаптическую передачу можно различными способами. Например, это можно делать, проникнув в нейронную цепочку с помощью методов электрофизиологии. Нейрон проявляет свою активность с помощью электрического тока, который можно измерить. Если экспериментатор возьмет цепочку из двух нейронов и, активировав один нейрон, зарегистрирует электрическую активность второго, он сможет выяснить, насколько хорошо проходит сигнал. Другой способ изучать функционирование синаптической передачи — исследовать морфологию нейрона. Дело в том, что многие нейроны (в том числе, нейроны коры и стриатума) имеют особые выросты мембраны — шипики, которые нужны им именно для образования синапсов (рис. 2). Чем более активно нейрон «общается» со своими соседями, тем больше на его поверхности шипиков. Взяв на вооружение эти два подхода, мы решили исследовать, как работает синаптическая передача при БХ.

В качестве модели для изучения болезни Хантингтона была использована клеточная культура из нейронов коры и стриатума. Для приготовления культуры незрелые нейроны из изучаемых зон мозга мышей высаживаются в чашки Петри, где они формируют полноценные нейрональные отростки и нейронные цепочки (рис. 3). Использовались мыши дикого типа (без мутаций) и мыши линии YAC128, которые несут мутацию в гене белка хантингтина и являются признанной моделью БХ. На 14–15 день после высаживания нейронов в чашку Петри они достигают зрелого состояния, соответствующего состоянию нейронов в мозге взрослого человека, а на 19–20 день нейроны считаются «старыми»: в них наблюдается ряд клеточных процессов, характерных для мозга пожилых людей. Кроме того, с возрастом в нейронах мышей YAC128 происходит накопление мутантного белка хантингтина и его агрегатов, поэтому изучение нейрональной культуры на этих двух этапах дает представление о том, что происходи в мозге пациента с БХ на ранней и на поздней стадиях заболевания.

Для начала мы исследовали морфологические отличия между двумя линиями, т.е. сравнили их внешний вид. Для нормальных нейронов стриатума характерно наличие большого количества шипиков, благодаря чему их называют средними шипиковыми нейронами (СШН). Именно шипики формируют большую часть синаптических контактов между нейронами стриатума и коры, и для осуществления нормальной синаптической передачи важно наличие определенного их количества. Так же важно и «качество» шипиков: в современной нейробиологии их разделяют на три группы согласно размеру и форме (рис. 4): грибовидные, тонкие и пеньковые. При этом шипики разных типов выполняют разные функции: считается, что только грибовидные шипики формируют активные синапсы, в то время как тонкие и пеньковые контактов с другими нейронами не образуют. Таким образом, для нормального функционирования нейронной цепочки и эффективной передачи информации по ней необходимо наличие определенного количества грибовидных шипиков.

Для того, чтобы узнать, сколько грибовидных шипиков должно быть на СШН в норме, на всех этапах морфологического анализа как контроль использовалась культура нейронов из головного мозга мышей дикого типа. Оказалось, что количество шипиков на СШН стриатума на 14 день культивирования (молодые нейроны) одинаково в культурах YAC128 и дикого типа, но на 20 день (у «старых» нейронов) наблюдаются значительные изменения (рис. 5). В «постаревшей» культуре YAC128 снижается общее количество шипиков, причем относительное количество грибовидных шипиков, которые образуют активные синапсы, уменьшается в два раза [10]. Получается, что морфологические изменения нейронов, свидетельствующие о нарушении синаптической передачи, развиваются только к «старости» (на поздней стадии заболевания). Значит, на ранних этапах корень проблемы должен лежать в другой области.

Поэтому мы сравнили электрофизиологические характеристики двух линий. Это возможно благодаря электрической активности нейронов, которую можно зарегистрировать с помощью специального метода, называемого пэтч-кламп. Для этого к поверхности нейрона прикладывают тонкую стеклянную пипетку, внутри которой находится электрод. Когда нейрон активируется, на его клеточной мембране изменяется напряжение, и это изменение регистрируется электродом. Если взять два связанных синаптическим контактом нейрона и, возбуждая один, регистрировать ответную электрическую активацию на втором, можно измерить эффективность передачи сигнала через синапс (рис. 6). Если ответная активация возникает не всегда, то, вероятно, синаптическая передача ослаблена. Этот метод может выявить нарушения работы синапса до изменений морфологии нейрона.

Чтобы активировать нейрон, можно использовать несколько способов. Можно добавить в окружающую его жидкость химическое вещество, открывающее ионные каналы, что приводит к электрическому возбуждению нейрона. Можно стимулировать нейрон электрическим током. Но мы для своих экспериментов выбрали более тонкий инструмент воздействия на нейроны, а именно — оптогенетику. Этот подход основан на внесении в нейроны специальных светочувствительных белков — опсинов, в результате чего и сами нейроны становятся чувствительными к свету (рис. 7). В результате, освещая нейроны светом определенной длины волны, можно изменять их активность. Освещение синим светом возбуждает нейрон, а желтым — вызывает торможение (т.е. подавляет активность нейрона).

Оптогенетические технологии в наши дни обещают даже вернуть зрение людям с дегенеративными поражениями сетчатки, придав световую чувствительность не разрушенным фоторецепторам, а клеткам-ганглиям: «Оптогенетика + голография = прозрение?» [11]. — Ред.

Электрическая активность нейронов выражается в резких скачках напряжения на клеточной мембране и появлении вследствие этого электрического тока. Эти резкие скачки называются спайками или потенциалами действия и длятся несколько миллисекунд (рис. 8). Мы выяснили, что чем дольше нейрон освещается синим светом, тем больше спайков он за это время создает. Если освещаемый нейрон связан синаптическим контактом с другим нейроном, то на втором нейроне можно зарегистрировать ответную активность — тоже в виде отдельных спайков.

В наших экспериментах мы использовали пару молодых (14 дней) нейронов коры и стриатума, связанных синаптическим контактом. Нейрон коры активировали синим светом, а на нейроне стриатума производили регистрацию ответной активности. Оказалось, что для возникновения ответа на нейроне стриатума нужна определенная длительность освещения (порог активации). Если длительность освещения была ниже порогового значения, то спайк на нейроне стриатума возникал в ответ не на каждую вспышку света. И что самое важное: порог активации для нейронов из мозга здоровых мышей отличался от мышей YAC128 (с мутацией в гене хантингтина). Наиболее ярко эта разница была видна при 50%-активации нейрона стриатума, т.е. длительности освещения, при которой спайк возникает в ответ на каждую вторую вспышку света. Порог 50%-активации нейрона стриатума в ответ на облучение кортикального нейрона для культуры клеток YAC 128 был примерно в два раза (точнее в 2,3±0,8) выше по сравнению с положительным контролем [10].

Получается, что мутация в белке хантингтине приводит к тому, что синаптическая передача ухудшается уже в молодых нейронах, и при этом нарушения происходят на функциональном уровне (без морфологических изменений). Может ли быть так, что именно эти функциональные нарушения в дальнейшем приводят к появлению морфологических изменений, таких как исчезновение шипиков у старых нейронов стриатума?

Чтобы ответить на этот вопрос, мы снова обратились за помощью к оптогенетике, но теперь с ее помощью мы подавляли светом активность нейронов (рис. 9а). Если наше предположение верно, то временное отсутствие активирующего воздействия коры должно привести к исчезновению шипиков на нейронах стриатума в культуре YAC128. Действительно, после эксперимента количество шипиков в положительном контроле осталось неизменным, но в культуре YAC128 значительно снизилось (рис. 9б, в). Получается, что моделирующие БХ нейроны особенно чувствительны к ослаблению активирующего воздействия нейронов коры, поэтому длительное ослабление синаптической связи между этими нейронами приводит к уменьшению количества шипиков на 20 день культивирования [10].

Таким образом, мы обнаружили, что в нашей модели БХ наблюдается нарушение синаптической передачи, которое развивается в два этапа. На ранней стадии (молодые нейроны, на 14 день культивирования нейронов) происходит функциональное ослабление сипаптической связи, которое на более поздней стадии (старые нейроны, на 20 день культивирования) приводит к морфологическим нарушениям синаптических контактов.

Вывод: нарушение синаптической передачи и нейродегенеративные заболевания

Исследование подтвердило нашу первоначальную догадку: нарушение работы стриатума при БХ связано, прежде всего, с нарушением синаптической передачи. Нейроны стриатума перестают «слышать» команды нейронов коры, и, в результате, человек начинает терять контроль над своими движениями. Но на ранней стадии заболевания эти нарушения носят функциональный характер и, вероятно, обратимы. Если выяснить причины, ведущие к нарушению работы синапсов, то возможно разработать лекарственное средство, которое поможет остановить патологические изменения, обеспечит нейронам стриатума необходимый уровень активации и, таким образом, предотвратит развитие необратимых морфологических нарушений.

Результаты этой работы подталкивают и к другому важному заключению: при изучении нейродегенеративных заболеваний ученым следует обратить больше внимания на синаптическую передачу и взаимодействие нейронов. Мы знаем достаточно много о том, как влияет накопление амилоидных агрегатов при болезни Альцгеймера на жизнедеятельность клетки, и какие нейроны погибают при развитии болезни Паркинсона, но это все еще не привело к появлению эффективной терапии. Возможная причина этих неудач — мы не учитываем последствия нарушения синаптических связей — те, которые мы открыли при исследовании болезни Хантингтона. Хочется надеяться, что наши находки подскажут исследователям направление для разработки эффективных способов лечения болезни Хантингтона, и Тринадцатая наконец-то будет здоровой!

Исследование было проведено в лаборатории молекулярной нейродегенерации СПбГПУ (зав. лаб. — проф. Техасского университета Илья Борисович Безпрозванный) под руководством к.б.н. Дмитрия Николаевича Артамонова.

Литература

1. Hayden M.R. Huntington’s Chorea. New York: Springer, 1982;
2. DR Langbehn, RR Brinkman, D Falush, JS Paulsen, MR Hayden, on behalf of an International Huntington's Disease Collaborative Group. (2004). A new model for prediction of the age of onset and penetrance for Huntington's disease based on CAG length. Clinical Genetics. 65, 267-277;
3. Идентифицированы белки, «слипающиеся» при болезни Гентингтона;
4. Sara Imarisio, Jenny Carmichael, Viktor Korolchuk, Chien-Wen Chen, Shinji Saiki, et. al.. (2008). Huntington's disease: from pathology and genetics to potential therapies. Biochem. J.. 412, 191-209;
5. Claire-Anne Gutekunst, Shi-Hua Li, Hong Yi, James S. Mulroy, Stefan Kuemmerle, et. al.. (1999). Nuclear and Neuropil Aggregates in Huntington’s Disease: Relationship to Neuropathology. J. Neurosci.. 19, 2522-2534;
6. Boxun Lu, James Palacino. (2013). A novel human embryonic stem cell-derived Huntington's disease neuronal model exhibits mutant huntingtin (mHTT) aggregates and soluble mHTT-dependent neurodegeneration. The FASEB Journal. 27, 1820-1829;
7. Benjamin Ray Miller, Ilya Bezprozvanny. (2010). Corticostriatal circuit dysfunction in Huntington’s disease: intersection of glutamate, dopamine and calcium. Future Neurology. 5, 735-756;
8. Нобелевская премия по физиологии и медицине (2013): везикулярный транспорт;
9. Karl Deisseroth. (2011). Optogenetics. Nat Methods. 8, 26-29;
10. Артамонов Д.Н., Коржова В.В., Ву Д., Рыбальченко П.Д., Им К., Красноборова В.А., Власова О.Л., Безпрозванный И.Б. (2013). Нарушения синаптической передачи при болезни Хантингтона на кортикостриатной модели культуры нейронов. «Биологические мембраны». 30, 1–13;
11. Оптогенетика + голография = прозрение?.