«Био/мол/текст»-2016

Эта работа опубликована в номинации «Своя работа» конкурса «био/мол/текст»-2016.

---

Спонсор номинации — Future Biotech, проект, объединяющий профессионалов и энтузиастов в области биологии и биотехнологий.

---

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

---

Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма «Атлас».

---

Спонсор публикации этой статьи — Оксана Горяйнова.

Немного про «лошадиное здоровье»

Если хотите рассмешить любого конника, то расскажите ему о лошадином здоровье. Но только аккуратно: владелец лошади, которая хоть раз в жизни хромала (а это каждый), расскажет и докажет вам, что поговорка уж точно не про коней. Дело в том, что болезни ног — причина № 2 (№ 1 — колики или боли в животе) обращения к ветеринару и самая частая причина завершения спортивной карьеры. Чаще всего встречаются травмы сухожильно-связочного аппарата (рис. 1) и суставов (тендинит и остеоартрит).

Травмы эти легко получить (достаточно неудачного прыжка), трудно вылечить и невозможно забыть. Традиционные методы лечения, такие как покой и противовоспалительные препараты, не дают должного эффекта: согласно статистике только 30% лошадей после традиционной терапии возвращаются к нормальным нагрузкам [1].

Открытия в области стволовых клеток и иммунологии, а также зарождение идеи регенеративной терапии заинтересовали и ветеринарных врачей, которые с большой надеждой стали применять новые разработки в практической медицине. К счастью, законодательство в области лечения животных не такое строгое, как в человеческой медицине, поэтому терапия стволовыми клетками и компонентами плазмы применяется в рутинном лечении хромоты лошадей уже около 12 лет.

Клиника, где я прохожу стажировку, применяет в лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата лошадей три метода:

• терапию плазмой, обогащенной тромбоцитами;
• терапию антагонистом интерлейкина-1;
• терапию стволовыми клетками.

Условно эти методы можно разделить на два типа: терапия плазмой и терапия стволовыми клетками.

Лекарство из собственной крови

Идея о том, что кровь может исцелять, не нова и уходит корнями в древность. Сейчас в лечении применяют два метода, при которых используют собственную кровь лошади [2].

PRP — Platelate Rich Plasma или плазма, обогащенная тромбоцитами

Механизм действия основывается на выделении тромбоцитами факторов роста, которые стимулируют пролиферацию местных бластоцитов, тем самым ускоряя нормальный процесс заживления [3]. Плазму (рис. 2) изготавливают из собственной крови лошади путем центрифугирования и активации тромбином или хлоридом кальция и под контролем УЗИ вводят в нужное место.

IRAP — Interleukin-1 Receptor Antagonist Protein или белок-антагонист рецептора интерлейкина-1

Метод терапии заключается в выделении из собственной крови лошади плазмы, обогащенной белком-антагонистом интерлейкина-1 [3]. Для этого у лошади отбирают 50 мл крови, инкубируют в течение 18–24 часов, центрифугируют и отбирают плазму, которую вводят в место травмы. Цель этого метода — уменьшить воспаление в ткани путем блокировки рецептора ИЛ-1.

Помимо самой травмы не меньшее повреждающее действие оказывает воспаление, которое, как известно, имеет свои неизменные шесть признаков:

• гипертермия, местный ацидоз и отек приводят к гипоксии и замедлению восстановления;
• боль и снижение функции приводят к повышению нагрузки на остальные три ноги, что повышает риск их травмы;
• покраснение (гиперемия), к счастью, не особо беспокоит ни животное, ни владельцев, да и под шерстью его нелегко найти.

Эти два метода относительно просты в применении, не требуют специальных цитологических навыков. Например, приготовление ПОТ доверили автору в первый день прохождения практики, чему я несомненно была удивлена: как? Это же клеточные технологии! Оказалось, что на практике не нужно ничего, кроме центрифуги и двух шприцов: один — чтобы забрать кровь, второй — чтобы забрать ПОТ из надосадочного раствора. Введение раствора мне уже не доверили — для этой процедуры нужны куда более глубокие знания в анатомии и УЗИ.

Но, как и всякий метод, терапия плазмой не совершенна.

Во-первых, одной инъекции недостаточно для восстановления поврежденной ткани, поэтому терапия повторяется курсом, препарат вводится через каждые 3–4 недели, что означает частые путешествия с животным в клинику (для некоторых лошадей поездки в коневозе — это отдельное шоу!). Хотя последняя проблема сейчас решается: врачи улучшают технологию получения ПОТ, появилась E-PET технология (рис. 3), которая не требует танцев со шприцами и центрифугой, поэтому врач может выехать к пациенту и сам.

Во-вторых, нужен постоянный контроль за процессом восстановления, потому что при недостатке собственных «средств» на нормальное восстановление ткани, например, сухожилие начинает восстанавливаться при помощи фиброзной ткани, которая «дешевле» для организма, прочнее, но, к сожалению, не такая эластичная, как первичная ткань [1]. В результате после восстановления у лошади может остаться хромота, не связанная с болью, а только с разной эластичностью ткани в двух ногах, что приводит к проблемам в работе и прохождению ветконтроля на соревнованиях. Также появляется риск вторичной травмы при нагрузке из-за ограниченной эластичности. Все это означает уход лошади на покой и бесполезность всего лечения и трат.

Стволовые клетки

В ветеринарной медицине используют несколько типов стволовых клеток: мультипотентные мезенхимальные, эмбриональные и индуцированные плюрипотентные [4], [5].

Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки хоть и ограничены в возможных специализациях, но они дифференцируются в остеобласты, хондроциты или адипоциты и как нельзя лучше подходят для лечения патологий опорно-двигательной системы.

Конечно, наилучшим типом стволовых клеток с точки зрения регенерирующих способностей являются эмбриональные: они тотипотентные, а значит, могут дифференцироваться в любой тип клеток организма, но с ними дела обстоят немного труднее. Проблема состоит в выделении, хранении такого типа клеток, а также в иммунным ответе [6] при использовании клеток от другого животного, ведь чаще всего собственные ЭСК отсутствуют. Еще одна проблема связана с теорией онкогенных стволовых клеток, но опыты на мышах и лошадях [6] показали, что клетки не дифференцируются в опухоль.

Третий тип клеток, который может быть использован в терапевтических целях — это индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, то есть клетки, которые перепрограммированны [7], [8]. Сейчас они имеют ограниченное применение в практической медицине, чаще используясь в лабораториях в качестве моделей для фармакологических исследований. Последние статьи [9] показывают, что эпидемиологи используют этот тип клеток для конструирования вакцины против венесуэльского вируса лошадиного энцефалита, поражающего не только коней, но и людей.

Как готовят клетки к применению?

Для приготовления к терапевтическому применению используют собственные ткани животного. Для этого под местной анестезией и часто седацией у животного берут кусочек ткани из грудины или жировой ткани на внутренней стороне хвоста. Все источники клеток показаны на рисунке 4.

Затем отобранный материал отправляют в лабораторию на дифференцировку и культивирование. Это занимает около недели.

После того, как клетки выращены, их также под контролем УЗИ вводят в пораженное место. Механизм действия заключается в том, что МСК, доставленные к цели, не начинают пролиферировать и дифференцироваться, как это считалось раньше, а только мобилизуют собственные ресурсы ткани путем выделения ростовых факторов (рис. 5, 6) [10].

По сравнению с предыдущими методами лечения терапия МСК значительно дороже, но она снижает вероятность замещения ткани на фиброзную в случае лечения тендинита [11], а также является единственной эффективной альтернативой операции в случае остеоартрита.

Исследования показали, что совместное применение стволовых клеток и терапии плазмой повышает шансы на выздоровление [12]. Весь процесс восстановления может занять до двух лет. Однако только введение стволовых клеток или плазмы еще не означает исцеление организма: для процесса восстановления необходимо много времени и терпения владельца животного, строгая программа реабилитации и, конечно же, немного удачи.

А как же остальные животные?

Кроме лошадей терапию стволовыми клетками применяют у собак и кошек при лечении остеоартрита или дегенеративных заболеваний позвоночника [13]. Но этот метод не очень широко распространен и уступает по популярности артроскопии. Но тем не менее клеточная терапия — реальная альтернатива для животных, у которых невозможна операция. Помимо этого, область применения терапии не ограничивается только патологиями опорно-двигательного аппарата: сейчас ведутся исследования по лечению патологий почек, печени и сердца [13] у собак и кошек, а также по лечению заболеваний глаз у лошадей.

Литература

1. Larson E. (2011). Stem cells and tissue healing in horses. The Horse;
2. Moura L. (2009). Autohemotherapy;
3. Hopper S.A. Regenerative medicine — understanding IRAP, PRP and stem cell therapies. Rood & Riddle Equine Hospital;
4. Lopez M.J. and Jarazo J. (2015). State of the art: stem cells in equine regenerative medicine. Equine Vet. J. 47, 145–154;
5. Fortier L.A. and Travis A.J. (2011). Stem cells in veterinary medicine. Stem Cell Res. Ther. 2, 9;
6. Guest D.J., Smith M.R., Allen W.R. (2010). Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Vet. J. 42, 636–642;
7. Ствол и ветки: стволовые клетки;
8. В поисках клеток для ИПСК — шаг за шагом к медицине будущего;
9. Braid L.R., Hu W.G., Davies J.E., Nagata L.P. (2016). Engineered mesenchymal cells improve passive immune protection against lethal venezuelan equine encephalitis virus exposure. Stem Cells Transl. Med. 5, 1026–1035;
10. Reed S.A. and Johnson S.E. (2014). Expression of scleraxis and tenascin C in equine adipose and umbilical cord blood derived stem cells is dependent upon substrata and FGF supplementation. Cytotechnology. 66, 27–35;
11. Vézina Audette R., Lavoie-Lamoureux A., Lavoie J.P., Laverty S. (2013). Inflammatory stimuli differentially modulate the transcription of paracrine signaling molecules of equine bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells. Osteoarthritis Cartilage. 21, 1116–1124;
12. Carvalho Ade M., Badial P.R., Álvarez L.E., Yamada A.L., Borges A.S., Deffune E. et al. (2013). Equine tendonitis therapy using mesenchymal stem cells and platelet concentrates: a randomized controlled trial. Stem Cell Res. Ther. 4, 85;
13. Markoski M.M. (2016). Advances in the use of stem cells in veterinary medicine: from basic research to clinical practice. Scientifica (Cairo). 2016, 4516920.