Статья на конкурс «био/мол/текст»: Методология биоаналитической химии, как, впрочем, и других естественных наук, развивается в направлении миниатюризации и сверхминиатюризации устройств. А недавние достижения в области нанотехнологий и исследования чувствительных полимеров смогли предложить абсолютно новые инструменты для биоанализа. Эта статья познакомит вас с методиками разработки наносенсоров для медицины и биологии, а также расскажет о проблемах, с которыми сталкиваются ученые в процессе их синтеза.
Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!
Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма «Атлас».
Часть 1. Вводная
Аналитическая химия — наука о методах определения химического состава вещества и его структуры [1]. Разработка новых, более чувствительных и точных методов анализа, конструирование новых приборов, а также совершенствование уже существующих методов, их автоматизация и компьютеризация — всё это задачи современной аналитической химии [2]. Одним из наиболее востребованных и быстро развивающихся ее разделов считается биоанализ. Именно он занимается разработкой технологий, связанных с анализом биомедицинских объектов: определением концентраций анализируемых веществ в образцах (ионов, метаболитов, биомолекул) и описанием свойств изучаемых тканей. С биоанализом тесно связаны токсикология, медицинская диагностика, фармакология и многие другие науки. Сложность исследуемых в биоаналитической химии объектов вынуждает использовать практически весь спектр современных химических, физико-химических, физических, а также биологических методов анализа.
Развитие современных методов биоаналитической химии направлено в сторону миниатюризации и сверхминиатюризации устройств для биоанализа, и это становится возможным благодаря нанотехнологиям и получению чувствительных полимеров. Но прежде чем описывать новые разработки, сделаем небольшой экскурс в историю и специфику развития биоаналитических методов и систем.
Краткая история развития биоаналитических методов исследования
Корни биоаналитики уходят глубоко в прошлое. Еще в 50-е годы до н.э. Клеопатра на своих рабах проверяла действие различных ядов (рис. 1). Таким образом, эти рабы, сами того не желая, стали одной из первых «биоаналитических систем». Кстати, по одной из версий, именно так небезызвестная египетская царица выбрала подходящий яд для совершения самоубийства: быстрый и позволяющий сохранить красоту даже после смерти.
Развитие же всех современных биоаналитических методов связано с молекулярным узнаванием — способностью молекул взаимодействовать друг с другом с высокой специфичностью и большим показателем силы взаимодействия (аффинности) [3], [4]. Ярким примером молекулярного узнавания можно считать, например, ферментативное: во время транскрипции, где участвует РНК-полимераза, и во время трансляции, где узнающими системами, наряду с мРНК, служат аминоацил-тРНК-синтетаза, рибосома и прочие факторы. С молекулярным узнаванием связан и такой важный прием в биоаналитической сфере, как молекулярное кодирование.
Теоретические основы процессов молекулярного узнавания описывает супрамолекулярная химия, иначе — химия молекулярных ансамблей и межмолекулярных связей. Ее основателем является Жан-Мари Лен [5], в 1987 году совместно с Ч. Дж. Педерсеном [6] и Д. Дж. Крамом получивший Нобелевскую премию по химии.
Дальнейшее развитие биоаналитических методов было связано с последовательным продвижением от биосенсоров к биочипам и в конце концов — к нанобиосенсорам. Итак, пойдем по порядку.
Биосенсоры —
аналитические устройства, использующие биологические материалы для «узнавания» определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. Автором первого биосенсора и биосенсорной концепции в целом по праву считается американский профессор-биохимик Леланд Кларк. В 1956 году Кларк опубликовал свою основополагающую работу[7], посвященную аналитическому применению изобретенного им кислородного электрода, который в дальнейшем получил название электрода Кларка. В 1962 году Кларк на выступлении в Нью-Йоркской академии наук озвучил идею совершенствования уже существующих в то время электрохимических сенсоров посредством их сопряжения с ферментами. Эту идею он подкрепил экспериментом с иммобилизованной на электроде глюкозооксидазой.
Биочипы —
размещенные на специальном носителе (платформе) биологические макромолекулы (ДНК, белки), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе [8]. Чаще всего платформы изготавливают из стекла или пластика, но иногда используют кремний. Основная доля (94%) производимых в настоящее время биочипов приходится на матрицы, несущие молекулы ДНК, — ДНК-чипы [9], [10]. Оставшиеся 6% составляют белковые чипы. Биочипы широко используются в диагностике in vitro. Их действие основано на молекулярном распознавании анализируемых молекул биополимерами, нанесенными на чип: на взаимодействии рецепторов с лигандами (например, антител с антигенами) либо на гибридизации комплементарных цепей ДНК. В частности, разработаны биочипы, распознающие короткие олигонуклеотидные последовательности и позволяющие регистрировать единичные мутации в генах. Высокие эффективность и специфичность таких микрочипов обеспечиваются в том числе и размерными характеристиками олигонуклеотидов (наномасштаб).
Наносенсоры —
любые биологические, химические или другие сенсорные точки для передачи информации о наночастицах на макроскопический уровень. Появлению разработок в области бионаносенсорики мы обязаны квантовым точкам (КТ) . Использование КТ в качестве зондов позволяет измерять параметры среды в локальных областях, размер которых сравним с размерами зонда.
Основными ограничениями в биологическом приложении наносенсоров стали токсичность и гидрофобность квантовых точек. Но логично предположить, что избежать связанных с этими моментами проблем можно, например, покрыв сенсоры каким-нибудь биосовместимым материалом, который одновременно будет решать проблему гидрофобности точек, иметь большое количество функциональных групп и при этом сохранять столь важные для нас оптические свойства КТ. Таким универсальным материалом являются разного рода полимеры.
Полимеры как «орган чувств»
Последние два десятилетия ознаменовались значительными подвижками в синтезе полимеров. Особенный подъем сейчас наблюдается в области чувствительных полимеров — мягких материалов, которые могут испытывать обратимые или необратимые изменения физических свойств и/или химической структуры, реагируя на разного рода внешние факторы или их комбинации: pH, температуру, ионную силу, излучение, механические вмешательства, электрические и магнитные поля, внешние добавки (ионы, биоактивные молекулы и т.п.) [12]. Возможность легкого манипулирования растворимостью, гидродинамическим объемом, конфигурацией и устройством цепи чувствительного полимера позволила разработать целые системы чувствительных полимеров с большим количеством новых функций. Таким образом, полимеры играют очень важную роль в детектировании и зондировании. Тем не менее системы детектирования, основанные на таких полимерах, всё еще находятся на этапе становления.
Часть 2. Дизайн систем типа КТ/полимер: концепция, методики, трудности
Столь активные попытки внедрения КТ в полимерные микро- и наносферы связаны как с возможностью легкого манипулирования строением и физическими свойствами полимеров, так и с несколькими другими немаловажными факторами. Первый, уже упомянутый, — это универсальность свойств полимеров: биосовместимость, обилие свободных функциональных групп, сохранение оптических свойств КТ. Второй связан с широким спектром возможных применений такого рода систем в области биоаналитики и фотоники.
Работа систем типа КТ/полимер может быть основана как на люминесцентных свойствах КТ, так и на других фотофизических процессах, например, на FRET-эффекте (фёрстеровском безызлучательном резонансном переносе энергии). В двух словах суть этого эффекта состоит в том, что при сближении двух объектов (донора и акцептора) и перекрытии спектра флуоресценции первого со спектром поглощения второго, энергия передается безызлучательно — и, если акцептор может флуоресцировать, он засветится с удвоенной силой [11].
На данный момент разработано множество способов внедрения КТ внутрь полимерных сфер. И хотя общепринятой методики всё еще не существует, количества проведенных исследований достаточно для того, чтобы выделить основные направления в развитии дизайна биологических наносенсоров. Итак, сейчас почти все методы можно условно разделить на три категории [14].
Синтез КТ непосредственно в присутствии полимеров. Особенность этого направления заключается в том, что полимер выступает в роли стабилизатора растущих нанокристаллов (НК) или, говоря иначе, обеспечивает ограничение зоны роста кристаллов, тем самым контролируя их средние размеры и обеспечивая малый разброс по ним. Но, к сожалению, большинство новых гибридов зачастую очень тяжело или вовсе невозможно получить таким путем, а синтез специализированных полимеров несколько опередил развитие синтеза КТ, в свете чего удалось детально прописать методы работы лишь с весьма ограниченным числом материалов. И хотя определенное количество новых КТ с уникальными свойствами таким путем всё же было получено, сильно перспективным такой метод назвать тяжело.
Прямая функционализация КТ макромолекулами (т.е. молекулами полимеров). Здесь был достигнут достаточно серьезный прогресс, причем как в случае покрытия КТ заранее подготовленным полимером, так и в случае выращивания полимера прямо на поверхности КТ. Проблемы этого направления в основном связаны с тем, что мы всё еще очень плохо разбираемся в специфических моментах электронных взаимодействий, происходящих на границе КТ—полимер.
Раздельный синтез КТ и полимеров с дальнейшим получением гибридов комбинациями разного рода стратегий молекулярной сборки. Именно это направление получило наиболее широкое распространение, поскольку объединяет в себе методологии двух предыдущих, отбирая наиболее удачные опыты, комбинируя их для получения «максимального КПД». Чаще всего в таком подходе используют методы эмульсионной и дисперсионной полимеризации [14], [15], присоединения КТ к полимерным микросферам с помощью полимеризуемых поверхностных лигандов [14], [16], [17], методы физического улавливания квантовых точек полимерами (рис. 2) [14], [18], иммобилизации КТ за счет сил электростатического взаимодействия [14], [19], внедрения наночастиц за счет последовательного разбухания/сжатия полимера [14], [17], [20] и, конечно же, методики послойной сборки [14], [21].
Рисунок 2. pH-зависимый фазовый переход стимулочувствительного PNIPAM-co-PVP-сополимера используют для внедрения/выпускания CdTe-нанокристаллов в/из сфер гидрогеля. При pH=3 микрочастицы полимера набухают, и КТ проникают внутрь полимерных сфер. По мере роста pH сферы сжимаются, заключая таким образом КТ в ловушку. При pH>11 КТ могут снова высвобождаться в раствор.
Особенно успешны подходы, основанные на разбухании полимера (рис. 3) и построении слоистых структур (рис. 4). Первый позволил получать гибриды с равномерным жестким распределением КТ по всему объему полимерных микросфер, что решает сразу две насущные проблемы дизайна наносенсоров: выпадение токсичных КТ из образцов и хаотичность интенсивности свечения каждого индивидуального нанозонда. Второй подход позволил создавать гибриды с контролируемой толщиной слоев и произвольной формой. Этот метод особенно примечателен тем, что заточен под нанесение слоев не только на ровные подложки, но и на сильно волокнистые материалы, а также полимерные микро- и наносферы, то есть метод можно использовать для производства совершенно разных гибридных наноструктур. Однако минусы есть абсолютно у всего: на изготовление каждого гибрида таким способом уходит слишком много времени. Именно поэтому послойная методика пока не может перейти в разряд фабричных.
Рисунок 3. Процесс внедрения водорастворимых КТ внутрь гидрофобных полистироловых (ПС) матриц. Отрицательно заряженные квантовые точки CdTe сначала покрываются положительно заряженными поверхностно-активными веществами (ПАВ) и переводятся в хлороформ. Далее КТ внедряются в ПС-микросферы в процессе их набухания в изопропаноле.
Рисунок 4. Послойная методика создания гибридной структуры типа КТ/полимер посредством взаимодействия водородных связей. В качестве поверхностных лигандов для покрытия КТ используется полиакриловая кислота. Подложка покрыта слоем положительно заряженных полиэлектролитов, на которых расположены модифицированные КТ. Последующие слои создаются за счет размещения поли(N-винилкарбазол-со-4-винилпиридина). Водородные связи образуются между карбоксильными группами в полиакриловой кислоте и частями пиридина.
Немного обособленной ветвью развиваются исследования гидрофилизации КТ. Самыми удачными и востребованными для дальнейшего дизайна биологических сенсоров являются методики, построенные на взаимодействии между октильным лигандом ТОФО на поверхности НК и алкильными группами амфифильных полимеров [17]. Таким образом можно получить не только коллоидно и химически устойчивые гидрофилизированные НК, но и большое количество функциональных групп, находящихся на поверхности квантовых точек, что, несомненно, облегчает процесс наматывания последующих слоев, необходимых для придания сенсору большей биосовместимости и специфичности.
Не менее популярна и гидрофилизация КТ посредством создания на них оболочки из сополимера малеинового ангидрида и 1-тетрадецена за счет гидрофобных взаимодействий (рис. 5), а также дополнительного покрытия уже гидрофилизованных ТОФО наночастиц полиэтиленгликолем (ПЭГ) (рис. 6).
Рисунок 5. Покрытие КТ сополимером малеинового ангидрида и 1-тетрадецена посредством гидрофобных взаимодействий. Для стабилизации оболочки в качестве сшивающего агента используются диамины. Раскрытые ангидридные кольца заряжают карбоксильные группы на поверхности КТ, делая их стабильными в водных растворах.
Рисунок 6. Структура триблочного полимера и покрытых им КТ.а — Схематическая иллюстрация КТ, покрытых триблочным сополимером. б — Сополимер, состоящий из трех блоков, каждый из которых разработан специально для реализации какой-то специфической функции: защиты in vivo, обнаружения лиганда, придания биосовместимости. Полимер самопроизвольно инкапсулирует покрытые слоем ТОФО наночастицы с помощью сильных гидрофобных взаимодействий. В итоге цепи полиэтиленгликоля или биологически активных молекул крепко сцепляются с полимерной оболочкой.
Подводя итоги раздела, хочется подчеркнуть, что, несмотря на различия между методиками изготовления гибридных наноструктур, все они направлены на решение одних и тех же проблем: биосовместимости, жесткого удержания КТ внутри полимера (выпадение КТ в организме в большинстве случаев может нанести ему непоправимый вред [22]), их равномерного распределении внутри образцов, а также регулирования количества КТ внутри каждого индивидуального наносенсора.
Часть 3. Применение гибридных микро- и наносфер в биологии и медицине
Гибридные микро- и наносферы типа КТ/полимер представляют значительный интерес для аналитической химии и биоинженерии. Такого рода нанокомпозитные материалы можно было бы использовать в проведении мультиплексированных биоанализов, для разработки новых инструментов медицинской диагностики, транспортировки и слежения за движением лекарственных препаратов внутри организма, а также для проведения комбинаторного химического синтеза.
В биологических исследованиях применяются в основном КТ, функционализированные амфифильными полимерами посредством сильных гидрофобных взаимодействий, а также гибриды, полученные прямым внедрением КТ в полимерные матрицы. Такими гибридами очень удобно метить клетки.
Флуоресцентный биоанализ с помощью гибридных микросфер может стать замечательной альтернативой обычному биохимическому анализу крови . Такой анализ будет основан на использовании латексных шариков, «нашпигованных» квантовыми точками нескольких цветов в строго определенных соотношениях. Таким образом можно будет реализовать идею мультиплексного оптического кодирования, применимого в биоанализе (рис. 7).
О «второй жизни», которую дарят квантовые точки старому доброму ИФА в деле диагностики рака, рассказывает статья «Лаборатория на ладони» [23]. — Ред.
Рисунок 7. Мультиплексное оптическое кодирование.а — Флуоресцентное изображение смеси ПС-шариков, отмеченных разными квантовыми точками CdSe/ZnS. б — Схема оптического кодирования, основанного на разнице в длине волн и интенсивности свечения КТ. Для получения характеристического соотношения цветов каждого индивидуального гибрида объем разных типов КТ (красных, зеленых, синих) можно изменять. Функционализация поверхности шариков рецепторами (А, B, C, D, E) позволяет производить идентификацию разных биособытий.
Еще одним замечательным примером применения гибридных систем типа КТ/полимер являются ратиометрические нанотермосенсоры, созданные группой исследователей из Института биоорганической химии РАН [24]. Принцип действия таких термосенсоров основан на FRET-эффекте. В их состав входят два разных типа квантовых точек: красные, находящиеся в ядре термосенсора, и зеленые — в его оболочке, покрытой термочувствительным полимером поливинилкапролактамом (ПВК) (рис. 8). Такая конструкция позволяет получать эмиссию флуоресценции, зависимую от температуры, а следовательно, позволяет проводить температурные измерения в пространственной области нанометрового диапазона и получать таким образом информацию о качестве протекания интересующих нас реакций in vitro (рис. 9).
Рисунок 8. Конструкция нанотермосенсора с переносом энергии между КТ ядра и оболочки.Сверху слева: в случае, когда длина волны эмиссии ядра меньше длины волны эмиссии оболочки, перенос энергии от ядра к оболочке приводит к одновременному тушению квантовых точек как ядра, так и оболочки, что должно приводить к снижению чувствительности сенсора. Внизу справа: если же длина волны эмиссии ядра больше длины волны эмиссии оболочки, перенос энергии от КТ оболочки на КТ ядра, наоборот, увеличивает флуоресценцию КТ ядра при одновременном тушении флуоресценции КТ оболочки. Эффект разнонаправлен в отношении КТ ядра и оболочки, что должно приводить к увеличению чувствительности сенсора.
Рисунок 9. Конфокальное изображение нанотермосенсоров на нагреваемой подложке и спектры флуоресценции единичного нанотермосенсора при температуре 24 °С и 42 °С. Использованы флуоресцентные КТ с длиной волны эмиссии 615 нм (ядро) и 540 нм (оболочка).
С помощью перечисленных выше методик и их комбинаций удалось получить слаботоксичные образцы, способные циркулировать в крови в течение достаточного для проведения необходимых анализов времени, а также проявляющие стабильность относительно гидролиза и процессов ферментативной деградации в исследованиях in vivo. Придумано множество схем использования гибридных нанокомпозитов в качестве биосенсоров и флуоресцентных меток. Не менее важную роль таким структурам отвели и в области фотоники и квантовой электроники.
Наблюдая за нынешними темпами развития этой области, а также учитывая уже достигнутые результаты, можно утверждать, что применение гибридных систем типа КТ/полимер в медицине и биологии стало просто вопросом времени. Рабочие гибридные системы такого рода можно будет считать уверенным шагом в мир наномедицины и нанотехники.
Больше Биомолекула рассказывает о биологии и медицине — сейчас у нас на сайте несколько тысяч статей. Если вам нравится наш сайт и вы хотите, чтобы он дальше работал, поддержите нас, пожалуйста, посильной суммой — разово или ежемесячно. Ежемесячные платежи предпочтительнее 😀
