Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.

---

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

---

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Встречайте спасителя!

Фитогормон ауксин — это своеобразный философский камень растительного мира: с его помощью растения залечивают свои раны и продлевают жизнь. Как и многие другие процессы в мире растений, ответ на ауксин активно изучают у модельного растения арабидопсис, с которым можно познакомиться ближе здесь [1]. Давайте посмотрим, что происходит в клетке на молекулярном уровне при попадании в неё ауксина.

Внешняя малость и простота молекулы ауксина (индолилуксусной кислоты) — лишь вершина айсберга событий, происходящих при его перемещении из клетки в клетку. Учёные долгое время не могли установить его точный рецептор. Дело в том, что существует два семейства ауксин-связывающих белков — TIR1/AFB и ABP1 (Auxin Binding Protein 1), и вначале кандидатом в рецепторы был именно второй, так как он был первым изолирован как белок, связывающий ауксин. Но затем стало понятно, что и без него растение нормально растёт, развивается и чувствует свой гормон [2].

Так что роль рецептора заслуженно взяли несколько гомологичных цитозольных белков TIR1/AFB. На самом деле, недавно открыли ещё и независимый мембранный рецептор, но его роль пока слабо изучена, поэтому оставим его в стороне [3].

При связывании с ауксином рецепторы TIR1/AFB становятся агрессивными и привлекают к себе целый белковый комплекс, который умеет пришивать к белкам «чёрную метку смерти» — убиквитин . Кто же заслужил такой кары?

Убиквитин — небольшой белок из 74 аминокислот, присутствующий во всех клетках эукариот (отсюда его название, переводящееся как «вездесущий»). Специальные ферментные системы, включающие белок убиквитинлигазу, пришивают его к другим белкам в клетке. Дальнейшая судьба покрытого убиквитином белка зависит от того, каким образом он к нему пришит: навешенная на белок цепочка убиквитинов, как правило, является сигналом для разрушения белка, а одиночные «подвески» убиквитина управляют белок-белковыми взаимодействиями и вызывают другие физиологические эффекты в клетке. Подробнее об этом можно прочитать здесь [4].

Для этого заглянем в ядро. В промоторах ауксин-чувствительных генов есть особые последовательности ДНК, с которыми связываются транскрипционные факторы ARF (Auxin Response Factors) — главные «молекулярные лошадки» ауксинового ответа, которые активируют или подавляют сотни ауксин-чувствительных генов [5]. Но без ауксина на них сидят репрессорные белки Aux/IAA, не давая «сдвинуться с места» — начать работать. Именно на Aux/IAA и навешивается убиквитин, отправляя репрессоров на деградацию и освобождая ауксиновых рабочих лошадок [6]. Так что сигнальный путь ауксина — не активирующий, а скорее «освободительный» (рис. 1)!

Как мы видим, ауксин при связывании с рецептором влияет на белок-белковые взаимодействия. Малая молекула, но собирается в большой комплекс: и рецепторы TIR1/AFB, и ферменты присоединения убиквитина, и репрессоры Aux/IAA. Это так необычно, что на ауксин обратили внимание не только специалисты по растениям. Оказалось, что если экспрессировать в клетках дрожжей или млекопитающих рецептор TIR1 (из арабидопсиса или риса), а к любому другому белку пришить участок от Aux/IAA (дегрон), то обработка ауксином вызовет деградацию именно того белка, к которому пришит дегрон! При этом TIR1 привлекает собственные ферменты клетки, присоединяющие убиквитин к дегрону. Систему проверили даже на живых мышах — ауксин вводили внутрибрюшинно (рис. 2). Такой способ разрушать белки очень удобен, потому что и TIR1, и IAA — белки, характерные только для растений; в других модельных системах их нет, а значит, можно провести деградацию нужного белка очень специфично [7].

В корнях ауксин изменяет уровень транскрипции около полутора тысяч генов, и это только в корнях; в других органах — другие мишени [8]. У арабидопсиса, как мы уже знаем, не один тип рецепторов ауксина, а также 29 типов репрессоров IAA и 22 типа транскрипционных факторов ARF — целая «армия». Вполне вероятно, что при воздействии ауксина на разные процессы есть определённая закономерность в выборе «участников», которую мы до конца пока не знаем, ведь в истории этого гормона ещё много белых пятен.

«Правила дорожного движения» для ауксина

В теории, ауксин может синтезироваться в любых живых клетках растений, однако на деле для регуляции развития (и регенерации, как мы увидим позднее) нужны именно градиенты ауксина. Клетки благодаря этому чувствуют «направление», в котором им нужно развиваться. Поэтому из участков максимума синтеза ауксин постепенно переносится в другие ткани. О механизме полярного транспорта ауксина между клетками подробно писали на «Биомолекуле» в статье «Ауксин — великий мотиватор» [9]. Если коротко, основной путь полярного транспорта можно описать так. Ауксин является слабой кислотой, поэтому снаружи клетки, где среда более кислая, чем внутри, он в основном представлен в протонированной незаряженной форме и может свободно проходить сквозь мембрану. Есть и вторично активный транспорт анионов ауксина внутрь клетки (за счёт энергии транспорта протонов), в котором участвует белок AUX1, однако он не так хорошо изучен. Внутри клетки ауксин диссоциирует, а его анионы накапливаются, оказавшись «взаперти». Пройти сквозь мембрану и выйти из клетки им помогают транспортёры PIN, которые расположены не по всей площади мембраны, а только в местах, куда ауксин должен «течь» (рис. 3) [10], [11].

Основная регуляция содержания ауксина в клетке проводится растением как раз за счёт манипуляции с белками PIN — их несколько типов со своими «рабочими местами». Благодаря этим белкам поток ауксина в корне выглядит как «фонтанчик» (рис. 4). Во-первых, это поддерживает особую структуру меристемы, а во-вторых, позволяет клеткам перестраиваться при нарушениях такого тока.

Зри в корень: строение меристемы корня

Мы более или менее разобрались с функционированием ауксина, теперь познакомимся с местом действия — кончиком корня. Говорят, что дерево держится корнями, поэтому залечивание ран в нём — залог спасения для растения. В корне находится одна из апикальных меристем (образовательных тканей), которая отвечает за рост. В меристеме живут недифференцированные стволовые клетки, у которых самая почётная среди клеток профессия — давать новое. Общая черта стволовых клеток растений и животных — их способность асимметрично делиться, причём потомки этих клеток пускаются в разные стороны. Одна остаётся дома в роли «мастера на все руки» для поддержания численности, а вторая даёт дочерние клетки, которые затем вступают на путь «взросления» и специализации — дифференцировки. Стволовые клетки не могут жить где попало: для их существования нужна организованная ниша, где их численность и дифференцировка строго контролируется специальными «надсмотрщиками», их называют организаторами ниши (рис. 5) [12].

В центре кончика корня находятся как раз четыре такие клетки-надсмотрщика — их называют покоящимся центром. Его со всех сторон окружают стволовые клетки, которые дают начало определённым тканям (рис. 6):

• проводящим ксилеме и флоэме, транспортирующим растворы солей и питательных веществ;
• эндодерме — «бюро пропусков» между проводящей системой и остальной частью корня, откуда приходят растворы солей из почвы для всего остального растения;
• основной ткани — паренхиме корня, образующей его кору;
• эпидермису — внешнему слою корня;
• корневому чехлику, предохраняющему корень от повреждений при росте в почве и участвующем в гравитропизме.

Сами клетки покоящегося центра делятся редко [13].

Естественно, такая многотканевость контролируется многими участниками: гормонами, короткими сигнальными пептидами, транскрипционными факторами. И, конечно, ауксин играет в этом процессе почётную роль. А вернее, именно градиент ауксина, который достигает максимума в покоящемся центре. В высокой концентрации он подавляет деление клеток покоящегося центра, зато рядом, в стволовых клетках, его более низкие концентрации способствуют делению и дифференцировке. Это показательный пример того, что для ауксина является закономерностью: его физиологическое действие зависит от концентрации и от того, на какие типы клетки он сейчас действует. Поэтому изучение молекулярного разнообразия его сигнальных путей так интересно исследователям.

Запруда на пути ауксина, R2D2 и два дирижёра в оркестре

На самом деле, ключевая роль ауксина в меристеме корня — это поддержание ниши стволовых клеток. Стволовые клетки очень нежные и легко погибают при механических, температурных и других неблагоприятных воздействиях. Раз ауксин поддерживает нишу стволовых клеток, то он должен участвовать и в процессах восстановления её популяции после повреждений. О том, что ауксин — важный участник процессов регенерации, уже писали  на «Биомолекуле» [9].

До недавнего времени всё ещё был открытым вопрос: как именно ауксин помогает растению излечиться от повреждений? Ответ нашли сразу несколько учёных из Бельгии, России, Австрии и Израиля в этом году [14–17]. Оказалось, что повреждённые клетки меристемы (в эксперименте учёные убивали их мутагеном блеомицином) создают препятствие-запруду на пути нормального тока ауксина в корне. В результате ауксин накапливался в клетках, примыкающих к мёртвым. Это случается потому, что окружающие повреждение клетки перестают синтезировать транспортер ауксина PIN1; в результате ауксин из них не выходит. Как при аварии около места скапливаются машины, так и ауксин накапливается в месте повреждения.

Тут стоит упомянуть, как учёные видят ауксин в клетках — с помощью трансгенной конструкции R2D2 [18]. Трансгенная конструкция в данном случае — это флуоресцентный белок, который нарабатывается и светится там, где идёт интересующий учёного процесс. Помните R2-D2 из «Звёздных Войн» и его датчик, светящийся то зелёным, то красным цветом в зависимости от настроения дроида? Так вот, работа датчика R2D2 у арабидопсиса в чём-то схожа: красный сигнал соответствует максимуму ауксина, зелёный — минимуму. В R2D2 два флуоресцентных белка: зелёный слит с участком ауксинового репрессора IAA, а красный — с его мутантным вариантом, нечувствительным к ауксину. Без ауксина нарабатываются оба белка: в микроскоп видно зелёный или желтый сигнал, а в присутствии ауксина зелёный белок покрывается убиквитином и деградирует, оставляя только красный сигнал. Убедитесь, как это красиво, взглянув на рисунок 7 и видео 1.

Учёные пошли дальше и нашли помощника ауксина в этом почётном деле — транскрипционный фактор ERF115. Для его активации, как оказалось, требуется и повышение концентрации ауксина (при блокировке его синтеза ERF115 не работал), и потеря окружающими клетками тургора (без повреждения ERF115 отсутствует даже там, где есть ауксин). То есть растение каким-то образом чувствует смерть своих клеток по падению давления на клеточную стенку и по накоплению ауксина.

ERF115 запускает репрограммирование соседних с повреждением клеток, чтобы они сами приобрели свойства стволовых и восстановили поврежденную меристему. Но кроме того, он и сам влияет на ауксин! А именно, активирует биосинтез ауксина в клетках, окружающих повреждение, а также активирует его сигнальный путь — транскрипцию гена одного из ауксиновых «рабочих лошадок» ARF5. Последний, вероятно, и запускает деление и восстановление утраченных клеток, но как именно, пока неизвестно. Главное, что налицо положительная обратная связь — чем больше ауксина, тем более активен ERF115, который, в свою очередь, активирует ауксин, и так до тех пор, пока повреждённые клетки не восстановятся! Без ERF115 ауксин не может вызвать регенерацию. Вот такая сложная схема: ауксиновая «запруда» и целых два дирижера в оркестре, без слаженной работы которых растение не выживет (рис. 8).

Путь камикадзе — жертва ради спасения

Ауксин спасает растения и тогда, когда наступают холода. Холод, как и генотоксичный агент блеомицин, повреждает ДНК в нежных стволовых клетках, а при длительном воздействии вызывает их гибель [19]. Он также подавляет работу практически всех PIN-белков, что уменьшает содержание ауксина в корне, особенно в клетках покоящегося центра. Для покоящегося центра снижение концентрации ауксина — это настоящая катастрофа, поскольку в таких условиях он не может поддерживать самообновление стволовых клеток, особенно клеток, сильно пострадавших от холодового стресса. Поэтому нужно любой ценой восстановить максимум ауксина в покоящемся центре.

Арабидопсис — явно неглупый организм, раз растёт практически везде, и он придумал довольно изящный механизм борьбы с холодом. Он избирательно уничтожает четыре дочерних стволовых клетки меристемы, которые располагаются под покоящимся центром. Эти клетки делятся обычно редко и дифференцируются в сторону корневого чехлика. Именно они гибнут при холодовом стрессе в первую очередь, сразу после деления (рис. 9). Смерть этих клеток программируемая: она вызвана белками, активизирующимися при повреждениях ДНК и осуществляющими обычно контроль клеточного цикла — они решают, разрешить ли клеткам делиться и жить дальше.

Гибель дочерних стволовых клеток не напрасна, потому что, жертвуя собой, они препятствуют току аксина и приводят к его накоплению в клетках покоящегося центра. Иными словами, умирающие стволовые клетки снова выполняют роль ауксиновой запруды, правда, не для того, чтобы запустить регенерацию, а для того, чтобы спасти главный «мозг» корня — покоящийся центр, принимающий решение о делении и дальнейшей судьбе стволовых клеток. В результате корни, в которых белки-контролёры целостности ДНК провоцируют смерть «камикадзе», лучше восстанавливаются от перенесенного холода. А значит, в конечном счёте именно ауксин отвечает за холодоустойчивость корней.

Заключение

Как видите, ауксин — действительно «живая вода» для повреждённых растений, «философский камень» со множеством функций в растениях и в руках исследователей. Приведем цитату одной британской исследовательницы развития растений Оттолайн Лайсер: «Когда дирижерская палочка ауксина указывает на вас, наступает ваша очередь играть, независимо от того, какой музыкальный инструмент у вас в руках» [20]. Действительно, ауксин так по-разному действует на разные ткани и органы, и неудивительно, что «живучесть» растений под руководством такого «мастера на все руки» очень высока.

Литература

1. Модельные организмы: арабидопсис;
2. Yangbin Gao, Yi Zhang, Da Zhang, Xinhua Dai, Mark Estelle, Yunde Zhao. (2015). Auxin binding protein 1 (ABP1) is not required for either auxin signaling or Arabidopsis development. Proc Natl Acad Sci USA. 112, 2275-2280;
3. Min Cao, Rong Chen, Pan Li, Yongqiang Yu, Rui Zheng, et. al.. (2019). TMK1-mediated auxin signalling regulates differential growth of the apical hook. Nature. 568, 240-243;
4. Вездесущий убиквитин;
5. D. Roeland Boer, Alejandra Freire-Rios, Willy A.M. van den Berg, Terrens Saaki, Iain W. Manfield, et. al.. (2014). Structural Basis for DNA Binding Specificity by the Auxin-Dependent ARF Transcription Factors. Cell. 156, 577-589;
6. Meirav Lavy, Mark Estelle. (2016). Mechanisms of auxin signaling. Development. 143, 3226-3229;
7. Aisha Yesbolatova, Yuichiro Saito, Naomi Kitamoto, Hatsune Makino-Itou, Rieko Ajima, et. al.. (2020). The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice. Nat Commun. 11;
8. N. A. Omelyanchuk, D. S. Wiebe, D. D. Novikova, V. G. Levitsky, N. Klimova, et. al.. (2017). Auxin regulates functional gene groups in a fold-change-specific manner in Arabidopsis thaliana roots. Sci Rep. 7;
9. Ауксин — великий мотиватор;
10. Anne Vieten, Michael Sauer, Philip B. Brewer, Jiří Friml. (2007). Molecular and cellular aspects of auxin-transport-mediated development. Trends in Plant Science. 12, 160-168;
11. Jiyoung Park, Youngsook Lee, Enrico Martinoia, Markus Geisler. (2017). Plant hormone transporters: what we know and what we would like to know. BMC Biol. 15;
12. Renze Heidstra, Sabrina Sabatini. (2014). Plant and animal stem cells: similar yet different. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 301-312;
13. Ernst Aichinger, Noortje Kornet, Thomas Friedrich, Thomas Laux. (2012). Plant Stem Cell Niches. Annu. Rev. Plant Biol.. 63, 615-636;
14. Balkan Canher, Jefri Heyman, Maria Savina, Ajay Devendran, Thomas Eekhout, et. al.. (2020). Rocks in the auxin stream: Wound-induced auxin accumulation andERF115expression synergistically drive stem cell regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 16667-16677;
15. Rotem Matosevich, Itay Cohen, Naama Gil-Yarom, Abelardo Modrego, Lilach Friedlander-Shani, et. al.. (2020). Local auxin biosynthesis is required for root regeneration after wounding. Nat. Plants. 6, 1020-1030;
16. Lukas Hoermayer, Juan Carlos Montesinos, Petra Marhava, Eva Benková, Saiko Yoshida, Jiří Friml. (2020). Wounding-induced changes in cellular pressure and localized auxin signalling spatially coordinate restorative divisions in roots. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 15322-15331;
17. N+1: «Давление и ауксин помогли корням растений залечить раны»;
18. Che-Yang Liao, Wouter Smet, Geraldine Brunoud, Saiko Yoshida, Teva Vernoux, Dolf Weijers. (2015). Reporters for sensitive and quantitative measurement of auxin response. Nat Methods. 12, 207-210;
19. Jing Han Hong, Maria Savina, Jing Du, Ajay Devendran, Karthikbabu Kannivadi Ramakanth, et. al.. (2017). A Sacrifice-for-Survival Mechanism Protects Root Stem Cell Niche from Chilling Stress. Cell. 170, 102-113.e14;
20. Ottoline Leyser. (2005). Auxin Distribution and Plant Pattern Formation: How Many Angels Can Dance on the Point of PIN?. Cell. 121, 819-822.