Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021

Эта работа заняла второе место в номинации «Академия & бизнес» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.

---

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

---

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

---

Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Вакцинация от коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 — одна из самых горячих тем на границе 2020 и 2021 гг. Не утихают споры о безопасности вакцин, разработанных в сжатые сроки, о принципах производства и об основных принципах иммуногенности. Много спорят и о том, стоит ли добровольно прививаться тем, кто уже успел переболеть COVID-19, или, по крайней мере, подозревает об этом. Достаточно ли привиться один раз, а если вирус будет мутировать, как действовать дальше? Достаточно ли переболеть один раз или стоит бояться заболеть одной и той же инфекцией раз в сезон?

Для того чтобы ответить на эти вопросы и понять историю прошлых болезней, нужно изучить иммунную память (также ее называют иммунологической). Как правило, для проверки иммунной памяти на конкретную инфекцию проверяют наличие антител в плазме крови: ИФА-тест на антитела класса IgG (ИФА — иммуноферментный анализ). В этом тесте подсчитывается количество антител, которые сорбируются (прилипают) к стандартизированным антигенам, то есть молекулам, встречающимся именно у возбудителя данной инфекции и нигде больше. Антитела, в особенности класса IgG, поразительно точно и выборочно контактируют с однажды «выбранной» молекулой: мало где в биологии можно найти более точные и постоянные молекулярные контакты. Тем не менее тест на антитела — по большей части дань историческому процессу, а не «золотой стандарт» тестирования иммунной памяти. Пандемия стремительно изменила многие аспекты нашей жизни — может ли она поменять и то, что мы считаем стандартом в диагностике иммунитета?

Увидеть адаптивный иммунитет

Запоминает инфекцию только адаптивный иммунитет: В-клетки и Т-клетки . Врожденный иммунитет имеет очень общие представления о типах инфекций, с которыми приходится бороться организму, и эти абстрактные, туманные представления выражаются в ограниченном наборе рецепторов в иммунных и эпителиальных клетках. Запомнить и различить разные типы вируса гриппа врожденный иммунитет не способен. Напротив, Т- и В-клетки заточены именно под задачу различения похожих молекул и выбора оптимальной реакции. И те, и другие формируют клон потомков после первой встречи с инфекцией. Часть клеток-потомков работает и расходуется сразу, другая часть сохраняется в специальных органах иммунной системы, к примеру, в красном костном мозге. Там клетки редко делятся, но могут быстро активироваться при повторном заражении — именно этот феномен называют иммунной памятью.

«Биомолекула» неоднократно писала об уникальных механизмах, которые обеспечивают работу этой удивительной регуляторной системы — системы адаптивного иммунитета человека [1–3].

Чтобы увидеть Т-клетки и В-клетки разных типов, иммунологи чаще всего используют проточную цитометрию (FACS) [4]. Например, если мы хотим увидеть клетки памяти, то крепим флуоресцентную метку на молекулу, присутствующую только на поверхности клеток иммунной памяти, и подсчитываем клетки, пролетающие по одной через лазер и детектор флуоресценции.

Так можно узнать процент клеток, выполняющих определенную функцию, например, весь объем клеток памяти в крови на все прошлые инфекции. Теперь усложним задачу и выделим только клетки памяти на конкретную инфекцию — например, интересующий всех SARS-CoV-2, — как это сделать? Мы можем увидеть недавно активированные клетки среди клеток памяти. Лимфоциты из образца крови пациента смешиваются и инкубируются с молекулами, принадлежащими вирусу, чаще всего, — с очищенными белками, нарезанными на фрагменты. Т- и В-клетки, способные узнать и связать вирусный антиген, активируются, станут активированными эффекторными клетками, и мы сможем их различить среди всей иммунной памяти на FACS-анализе. Такие тесты проводятся в качестве дополнительных научных исследований.

Тест требует не только несколько часов на выделение клеток и их активацию вирусными белками либо пептидами, но и время дорогостоящего специалиста по проточной цитометрии, у которого прибор для FACS всегда работает и настроен, а не простаивает. Сочетание сразу двух факторов приводит к тому, что метод далеко не массовый. Можно представить метод рутинным в нескольких ведущих медицинских центрах, но сложно распространить: на порядки сложнее, чем внедрить регулярное ПЦР-тестирование.

Антитела или Т-лимфоциты

В качестве гораздо более дешевого и доступного теста, чем FACS, иммунологи смотрят не на сами клетки, а на то, что иммунные клетки производят [5]. Вспомним рецепторы, которые служат для решения задачи точного, прочного и выборочного связывания вирусных белков-антигенов. Т-клетки держат рецепторы на поверхности, на клеточной мембране. А вот В-лимфоциты свои уникальные рецепторы синтезируют как в мембранной, так и в растворимой форме — эти растворимые В-клеточные рецепторы и есть антитела. Получается, что вместо флуоресцентных меток и В-клеток памяти можно просто измерить концентрацию антител? Вдобавок, учебник иммунологии рассказывает, что В-клетки формируют память с помощью Т-клеток. Значит ли это, что если антитела есть, то уже произошло формирование памяти: сначала на уровне Т-клеток, затем на уровне В-клеток?

Да, текущие представления об иммунологии человека говорят: высокий уровень антител подразумевает, что Т-клеточный иммунный ответ тоже есть. Тем не менее известны и неклассические механизмы, при которых В-клетки быстро начинают производить антитела (чаще классов IgD, IgM) вне особых зон лимфоузла и при меньшем контроле со стороны Т-клеток. Обратная логика оказывается неверной: Т-клеточная иммунная память не зависит от наличия антител в крови, формируется независимо и сохраняется дольше.

Интуитивно кажется, что было бы отлично сохранять в крови антитела к коронавирусу после вакцинации или инфекции на всю жизнь. Некоторые инфекции формируют такой иммунный ответ, и это коррелирует с иммунной защитой, то есть вероятностью не заболеть при повторном заражении [6]. Но для других инфекций уровень антител в крови достаточно быстро, за несколько месяцев, снижается. Так происходит потому, что за свою жизнь человек встречает сотни тысяч типов вирусов, и производить антитела на все вирусные антигены просто невозможно. Приходится выбирать, происходит конкуренция с защитой от других инфекций, а также конкуренция с антителами, которые нужны для регуляции собственной физиологии организма. Антитела постепенно снижают концентрацию и пропадают из крови, но сохраняются В-клетки памяти, которые смогут вновь производить нужные антитела при необходимости.

Было бы идеально, чтобы организм производил антитела и держал их в оптимальной концентрации в крови не во время повторной болезни, а чуть заранее: до заражения. Именно для этого существуют сезонные ревакцинации: небольшая бустерная доза антигена поступает заранее и через 9–14 дней иммунитет снова подготовлен к сезонному контакту с большим количеством вирусных частиц вокруг. А постоянное, круглогодичное производство антител на высоком уровне можно оставить тем В-лимфоцитам, которые действительно каждый день сталкиваются с одними и теми же бактериями и вирусами: например, В-лимфоцитам слизистой ЖКТ, работающим с кишечными симбионтами.

ELISPOT: ИФА для Т-клеток?

Антитела оказались удобным для измерения косвенным маркером иммунной памяти, но отсутствие антител еще не говорит об отсутствии Т-клеточной памяти. Специфичную иммунную память Т-клеток, к сожалению, нельзя измерить так же легко, по нескольким миллилитрам плазмы крови. Как упоминалось выше, Т-клетки не секретируют свои рецепторы в растворимом виде. Зато Т-лимфоциты, в соответствии со своей ролью дирижеров всего иммунного ответа, вырабатывают множество сигнальных молекул — цитокинов. Цитокины, в большинстве своем, — тоже растворимые молекулы, и их концентрацию можно измерить в объеме (суммарно), либо «подсветить» с помощью флуоресцентных меток сразу при их секреции из специфичных Т-клеток (и увидеть соответствие клетка—сигнал). На этом принципе основан иммуноферментный анализ на клональных отпечатках Т-клеток, или ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot).

Как правило, Т-хелперы секретируют сигнальные цитокины, чья основная задача — активировать нужную ветвь иммунного ответа, привлечь клетки врожденного иммунитета и подавить конкурирующие сигналы. Среди функций цитокинов — подача сигналов внутри иммунной системы — от Т-клеток и для Т-клеток для уточнения принятия решений. Подобная информация «для внутреннего использования» передается и от Т-хелперов Т-киллерам, и в обратном направлении. Яркий пример такого сигнала — интерферон-гамма: активированные Т-киллеры секретируют IFNγ наравне с Т-хелперами. Массовая выработка интерферона позволяет быстро распространить информацию на уровне всего организма. На основе измерения продукции IFNγ Т-клетками разработан самый надежный из ELISPOT-тестов на антиген-специфичный Т-клеточный ответ [7], [8].

Для ELISPOT живые изолированные Т-клетки периферической крови инкубируются с антигенами, как правило, белковыми либо пептидными. Этот процесс должен имитировать то, как в организме Т-клетки в лимфоузлах узнают антигены и активируются: процесс презентации антигена. Небольшая доля специфичных клеток узнает антигены и производит IFNγ, причем интерферон сразу фиксируется и позже визуализируется в точке секреции. В процессе активации Т-клетки делятся: из одной клетки образуется целый клон антигенспецифичных клеток, все они производят интерферон, и при визуализации «пятно» продукции интерферона растет в диаметре (рис. 1). При ELISPOT сложно точно сказать, сколько антигенспецифичных клонов было изначально в образце до активации, размножения и формирования пятна. Остается неясным, сколько Т-клеток узнают антиген in vivo, но не прореагировали из-за искусственной формы презентации антигена, не похожей на то, как Т-клетки обычно активируются в лимфоузлах. С другой стороны, метод немного проще оптимизировать в лаборатории и проще делать для многих пациентов одновременно, чем более дорогостоящий FACS-анализ; требующиеся приборы и реагенты дешевле.

Поиск коронавирусных Т-клеток. Инновация TScan

ELISPOT используется во всех лабораториях, которые исследуют иммунитет человека. Метод ELISPOT и его модификации на пересекающихся пулах пептидов (наборах фрагментов, на которые нарезается белковый антиген) использовались в исследованиях эффективности вакцин от ВИЧ, и позже медленно распространились на исследования и других вакцин. В диагностических лабораториях метод стал популярен потому, что для более точной диагностики туберкулеза необходимо оценивать Т-клеточный иммунный ответ. Коммерческий тест получил название T-SPOT. Кроме туберкулеза, для других инфекций аналогичная диагностика не применялась — до 2020 года и кризиса, вызванного новой коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2. Необходимость широкой диагностики самой инфекции и иммунной памяти к ней подтолкнула одновременно исследователей и производителей диагностических тестов к разработке новых методов и оптимизации старых и привычных. Интерес к быстрому и дешевому измерению Т-клеточной памяти растет параллельно с популярными в медиа опасениями, что у переболевших COVID-19 быстро пропадают антитела в крови.

Очень многие академические коллективы, которые работают на стыке биохимии, иммунологии человека и прикладных биотехнологий, весной 2020 года стали заниматься разработками для борьбы с пандемией, в том числе разрабатывать и налаживать диагностику инфекции. Нельзя не упомянуть пример коллектива Григория Ефимова из НМИЦ гематологии в Москве, активно работающий как над диагностикой Т-клеточного иммунитета к новому коронавирусу на основе FACS, так и в коллаборации по созданию одного из ИФА-тестов для определения антител к антигенам SARS-CoV-2 [9], [10]. Тем не менее вернемся к теме масштабируемого производства быстрых ELISPOT-тестов на Т-клеточный иммунитет: откуда берутся такие разработки, тоже из фундаментальных и клинических академических лабораторий?

Первой ELISPOT-тест на ковид (T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 assay) выпустила компания Oxford Immunotec, ранее создавшая одну из самых популярных версий теста на туберкулез [11]. Этот тест использует пул разнообразных антигенов коронавируса и активацию Т-клеток в смеси с другими лейкоцитами периферической крови: иначе говоря, дизайн теста даже несколько упрощен по сравнению с тестом на туберкулез (рис. 1).

Куда более интересную модификацию запустил небольшой биотех-стартап под названием TScan Therapeutics. Этот стартап переориентировался на инфекционную иммунологию во время пандемии. Как и многие другие коллективы, к примеру, BioNTech (разработчик вакцины от коронавируса совместно с Pfizer), до пандемии они занимались онкологией и задачей оптимальной активации противоопухолевого иммунитета.

Осенью 2020 года TScan Therapeutics подписали соглашение о совместной разработке диагностического теста ELISPOT-типа с компанией Qiagen — крупнейшим производителем лабораторных реагентов и универсальных наборов для типовых экспериментов в молекулярной и клеточной биологии [12], [13]. Эта диагностика Т-клеточной памяти во многом отличается от версии Oxford Immunotec, и в первую очередь отличается идеологически: оксфордская компания быстро и практично сделала аналог своего существующего продукта-бестселлера, сохранив всю платформу и протокол метода и изменив только антиген. TScan же демонстрирует почти идеальный инновационный подход: вначале провели исследования Т-клеточного иммунитета, опубликовали выводы в престижном журнале Immunity, затем появилась идея для диагностического теста и, наконец, возможность производства в партнерстве с Qiagen.

Исследование TScan раскрывает детали того, какие молекулы среди белков коронавируса вызывают наибольший «интерес» у Т-клеток человека [14]. Иммунная память Т-киллеров, согласно исследованию, формируется не только и не столько на фрагменты антигена (эпитопы) S-белка коронавируса, на котором сфокусировано большинство вакцин 2020 года [15]. Напротив, эпитопов гораздо больше в нуклеокапсидном основном белке [16]. Далее, специалисты TScan показали отсутствие перекрестного иммунитета: антигены «сезонных» неопасных человеческих коронавирусов формируют память Т-киллеров, но эти Т-киллеры не способны отреагировать на коронавирус SARS-CoV-2. Наоборот, между SARS-CoV-1 (вызвавшим вспышку атипичной пневмонии в 2003 году) и SARS-CoV-2 существует значительная кросс-реактивность Т-клеток (переболевшие атипичной пневмонией могут быть защищены от SARS-CoV-2).

Обнаружение важнейших участков вируса, вызывающих долгую Т-клеточную память — это поиск иммунодоминантных эпитопов. Если активировать Т-клетки именно такими пептидами, можно существенно повысить качество диагностического теста. Уникальные данные TScan позволяют вычесть фон иммунной памяти на родственные и далекие коронавирусы и поднять специфичность диагностики иммунной памяти. При этом используется платформа, сходная с ELISPOT, что позволяет объединять много образцов и делать тест быстрым и широко доступным. Сейчас исследования Т-клеточного иммунитета при коронавирусе проводится либо в рамках научных исследований, либо на коммерческой основе, но точность и интерпретация теста затруднена, клиент получает результат через 1–2 неделю после теста. Партнерство TScan с Qiagen вселяет оптимизм по поводу доступности теста: ведь продукцией этой компанией пользуются буквально в каждой молекулярной и биохимической лаборатории на планете.

Интересна еще одна деталь. Исследователи из TScan брали донорские Т-клетки у доноров с наиболее распространенными в США генотипами других важных иммунных молекул: молекул HLA (молекул главного комплекса гистосовместимости, Human Leukocyte Antigen) подтипов HLA-A*02:01, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*24:02 и HLA-B*07:02. В зависимости от типа молекул HLA Т-клетки будут распознавать разные эпитопы одного и того же вируса. А поскольку у разных людей максимально вариабельные молекулы HLA, то и иммунный ответ Т-клеток у каждого формируется максимально индивидуально. Именно с этим связаны и сложности/дороговизна изучения Т-клеточного иммунитета, и невозможность «перелить иммунную память» переливанием крови — такой эксперимент может получиться только внутри пары однояйцевых близнецов. С другой стороны, даже в этом огромном разнообразии реакций клеточного иммунитета Т-клетки разных доноров, отвечающие на новый коронавирус, обладают некоторыми общими характеристиками.

Данные об общих параметрах иммунного ответа, которые будут накапливаться в совместных исследованиях TScan/Qiagen, представляют несомненный интерес для оптимизации лечения пациентов и создания методов лечения, таргетно направленного на активный и безопасный Т-клеточный ответ. Здесь проявляется особая черта сильных deeptech-стартапов в области биологии, биоинформатики и биотехнологий: технологическая платформа может быть использована не только для одного применения и быстрого завоевания рынка, а для разных задач, и в процессе, по ходу решения прикладной задачи возникают ценные, качественные и заметные научные открытия. Конечно, новость о сотрудничестве TScan и Qiagen — всего лишь одна из множества историй о биотех-прорывах 2020 года, и легко могла затеряться среди других новостей и инноваций. Но в этой неприметной новости заложен мощный потенциал, способный изменить современные представления о клинической диагностике иммунной памяти.

Литература

1. Анализ индивидуальных репертуаров Т-клеточных рецепторов;
2. Т-лимфоциты: путешественники и домоседы;
3. Иммунитет: борьба с чужими и… своими;
4. 12 методов в картинках: проточная цитофлуориметрия;
5. 12 методов в картинках: иммунологические технологии;
6. Jon Cohen. (2019). How long do vaccines last? The surprising answers may help protect people longer. Science;
7. Yasushi Miyahira, Kenichiro Murata, Dolores Rodriguez, Juan R. Rodriguez, Mariano Esteban, et. al.. (1995). Quantification of antigen specific CD8+ T cells using an ELISPOT assay. Journal of Immunological Methods. 181, 45-54;
8. Alexey Karulin, Kinga Karacsony, Wenji Zhang, Oleg Targoni, Ioana Moldovan, et. al.. (2015). ELISPOTs Produced by CD8 and CD4 Cells Follow Log Normal Size Distribution Permitting Objective Counting. Cells. 4, 56-70;
9. Ершов А. (2020). Тесты на антитела к коронавирусу нужны для поиска переболевших и лечения больных. Мы поговорили с учеными, которые их разрабатывают. Meduza;
10. Alina S. Shomuradova, Murad S. Vagida, Savely A. Sheetikov, Ksenia V. Zornikova, Dmitry Kiryukhin, et. al.. (2020). SARS-CoV-2 Epitopes Are Recognized by a Public and Diverse Repertoire of Human T Cell Receptors. Immunity. 53, 1245-1257.e5;
11. T-SPOT®Discovery SARS-CoV-2: proven T cell technology. (2020). Oxford Immunotec;
12. TScan Therapeutics announces partnership with QIAGEN to develop T cell-based laboratory test for comprehensive COVID-19 immune response. (2020). BioSpace;
13. Khan T. (2020). Qiagen collaborate with TScan to develop T cell-based COVID-19 test. PharmaShots;
14. Andrew P. Ferretti, Tomasz Kula, Yifan Wang, Dalena M.V. Nguyen, Adam Weinheimer, et. al.. (2020). Unbiased Screens Show CD8+ T Cells of COVID-19 Patients Recognize Shared Epitopes in SARS-CoV-2 that Largely Reside outside the Spike Protein. Immunity. 53, 1095-1107.e3;
15. Yetian Dong, Tong Dai, Yujun Wei, Long Zhang, Min Zheng, Fangfang Zhou. (2020). A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Sig Transduct Target Ther. 5;
16. Корум Д. и Циммер К. (2020). Плохие новости в протеиновой обертке: в геноме у коронавируса. Open Longevity.