https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/products-and-services/promotions/30-years-discovery-russia-promo.html?cid=PJT4417-WE42944-Biomolecula-Russia-30yearsinRussiaBanner-November
Подписаться
Биомолекула

«Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

«Дизайнерские» ферменты защищают от нервно-паралитических ядов

  • 1315
  • 1,3
  • 8
  • 1
Добавить в избранное printer
Новость

Несмотря на то, что эффективность отравляющих веществ как оружия массового поражения довольно низка, все же спокойнее знать, что существует противоядие! Контур вторичной структуры фермента: сывороточная параоксоназа, послужившая «шаблоном» для дизайна белка-противоядия.

Несмотря на то, что химическое оружие, к счастью, практически не применяется в военных действиях, наличие средств химической защиты — важная составляющая обороноспособности и обязательное требование для чрезвычайных ситуаций. Одни из самых опасных отравляющих веществ — фосфорорганические яды, обладающие нервно-паралитическим действием, — были созданы еще до Второй мировой войны, однако эффективного противоядия от них до сих пор не существует. Группа ученых в Израиле применила подход направленной эволюции, чтобы «в пробирке» создать фермент, способный стать антидотом для двух самых токсичных ядов этой группы, — зомана и циклозарина.

Первое применение боевых отравляющих веществ (ОВ) относится к 1915 году, когда Германия вблизи бельгийского города Ипр использовала химическое оружие (хлор), в связи с чем заняла выигрышную позицию в бою с англо-французскими войсками. Годом позже в этом же месте был опробован иприт, получивший свое название именно по данной местности. После Первой мировой войны химическое оружие применялось лишь эпизодически, хотя долгие годы разрабатывались все новые его поколения и средства химической защиты. (Военные исследования говорят, что химическое оружие крайне низкоэффективно как средство массового поражения, но обладает мощнейшим психологическим эффектом и наносит существенный урон мирному населению.)

Представители фосфорорганических ядов G-серии

Рисунок 1. Представители фосфорорганических ядов G-серии. Зоман — самый токсичный из этой серии: среднесмертельная концентрация при действии через органы дыхания составляет 0,03 мг×мин/л. Основная защита от этих ОВ — противогаз и средства защиты кожи. Снизу: Демонстрационная боеголовка американской ракеты Honest John, «нашпигованная» контейнерами M139 с зарином (фото: около 1960-х).

Как и иприт, фосфорорганические яды были синтезированы в Германии, но только перед Второй мировой войной. G-серия — это самое первое и старое семейство фосфорорганических ОВ, обладающих нервно-паралитическим действием: к нему относятся табун (GA), зарин (GB), зоман (GD) и циклозарин (GF) (рис. 1). К счастью, эти ОВ никогда не применялись массово, за исключением конфликтов между Ираном и Ираком. Парижская Конвенция о химическом оружии, вступившая в силу в 1997 году, запрещает использовать, хранить и создавать химическое оружие, в том числе — и зарин с зоманом. Однако, как показали печально известные теракты с применением зарина в Японии в середине 1990-х, всегда нужно быть готовым к опасности, даже если она возникла из-за «нечестного» применения вооружений.

Нервно-паралитическое действие фосфорорганических ОВ обусловлено тем, что они ингибируют ацетилхолинэстеразу — фермент, катализирующий гидролиз нейромедиатора ацетилхолина в синапсах, — вызывая спазм мышц и паралич, приводящий в итоге к смерти от удушья. Основным антидотом в настоящее время является атропин, однако он не только малоэффективен и обладает массой побочных эффектов, но и не спасает от общего отравляющего действия фосфорорганики. Оптимальным антидотом был бы фермент, «перехватывающий» молекулы ОВ до того, как они начнут действовать в конечных органах, «отравляя» ацетилхолинэстеразу; мало того, такие ферменты есть, но их специфическая активность настолько низка, что в разумных дозах они не могут защитить организм от отравления. Дело в том, что фосфорорганические яды — это молекулы, созданные человеком, и поэтому природа не позаботилась о том, чтобы породить высокоэффективные ферменты, их расщепляющие. Подсчитано, что «минимально достаточная» эффективность такого фермента для применения в качестве антидота, должна быть kкат/KM = 107 M−1×мин−1.

И вот в Израиле команда исследователей из Института Вейцмана под руководством Дэна Тавфика (Dan Tawfik) с помощью метода «эволюции в пробирке» получила фермент, с требуемой эффективностью расщепляющий фосфорорганику и годный для использования в качестве антидота при поражении этими ОВ [1]. Лаборатория Тавфика занимается изучением эволюционного развития и механизмов работы ферментов, и на её счету уже немало работ, связанных с искусственной эволюцией ферментов для оптимизации у них желаемых качеств. В большинстве случаев удавалось повысить активность в сотни или даже тысячи раз, а в совместном исследовании с американцами использование компьютерного моделирования даже позволило создать фермент с совершенно новой функцией (см. «Дизайнерские ферменты на службе общества» [2]).

В этой работе [1] компьютерное моделирование не использовали, а за отправную точку взяли подробно изученный в лаборатории Тавфика фермент PON1, основная функция которого — расщепление продуктов окисления липидов в крови и, в силу этого, противостояние атеросклерозу. Что интересно, оказалось, что PON1 «подрабатывает» и расщеплением фосфорорганических соединений (с очень низкой эффективностью, kкат/KM = 8×104 M−1×мин−1), что и стало «целевым свойством», которое решили оптимизировать учёные.

Процедура искусственной эволюции (см. врезку) заключалась во внесении в белок большого количества мутаций — как наперед заданных (остатки активного центра), так и случайных. Результирующие мутантные варианты проверяли на активность сначала по расщеплению малотоксичного аналога зомана, а потом — по эффективности «защиты» ацетилхолинэстеразы от «отравления» циклозарином; такие «эволюционные циклы» повторяли несколько раз. Что интересно, поскольку лаборатория Тавфика не имела доступа к работе с нервно-паралитическими и другими высокотоксичными веществами, был разработан оригинальный способ тестирования: циклозарин нигде не хранился и не добавлялся в пробирку извне, а синтезировался прямо в жидкой фазе, уже не имея возможности отравить сотрудников путем передачи через воздух. Этот способ тестирования позволил выбрать один из мутантных аналогов, эффективно «защищавших» ацетилхолинэстеразу, и эксперименты на животных с инъекцией одного из аналогов зомана показали перспективность использования этого фермента в качестве антидота: выживаемость мышей повысилась более чем в пять раз.

Исследователи собираются в кооперации с врачами усовершенствовать свой фермент, добившись защиты от всех распространенных фосфорорганических ОВ и снизив иммуногенность, а также дополнительно повысив эффективность, чтобы антидот можно было принимать не только заблаговременно, но и уже после контакта с ядом (хотя и в этом случае, понятно, придется поспешить).

Использованы материалы ScienceDaily [4].

Литература

  1. Rinkoo D Gupta, Moshe Goldsmith, Yacov Ashani, Yair Simo, Gavriel Mullokandov, et. al.. (2011). Directed evolution of hydrolases for prevention of G-type nerve agent intoxication. Nat Chem Biol. 7, 120-125;
  2. Дизайнерские ферменты на службе общества;
  3. Dan S. Tawfik, Andrew D. Griffiths. (1998). Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat Biotechnol. 16, 652-656;
  4. Accelerated evolution used to develop enzymes that provide protection against nerve gas. (2011). ScienceDaily.

Комментарии