Конкурс «био/мол/текст»-2013

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Лучший обзор».

---

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Изучение эволюции живых организмов невозможно представить без изучения их предков и «родственников» — отдаленных и близких. Долгое время считалось, что палеонтологические методы малоприменимы для изучения эволюции микроорганизмов, поскольку относительно малые размеры и отсутствие скелета не позволяют им сохраняться в окаменелостях в доступном для изучения виде. Исключение составляют, пожалуй, только цианобактерии, которые оказались способными формировать окаменелости двух типов: строматолиты (прижизненно минерализованные многослойные колонии) и микрофоссилии (одиночные минерализованные бактериальные клетки).

Значительный прогресс в палеомикробиологии был достигнут относительно недавно, когда было выяснено, что отдельные биологические молекулы могут сохраняться в палеонтологических образцах в течение миллионов лет. К счастью, одной из таких молекул является ДНК, что позволяет использовать обнаруженные фрагменты этого вещества для идентификации древних микроорганизмов и изучения их биологического разнообразия.

«Рекордсменами по выживанию» являются ДНК микроорганизмов, законсервированных внутри кусочков янтаря. В янтаре возрастом 25–35 млн. лет обнаружены, в частности, фрагменты ДНК стафилококков [1]. Применительно к микроорганизмам, вызывающим эпидемические инфекционные заболевания у человека, интерес представляют более поздние находки, связанные не только с палеонтологическим, но и с археологическим материалом. Как оказалось, возбудители инфекционных заболеваний, которые сопровождаются бактериемией (то есть проникновением возбудителя в кровь), — такие, например, как возбудители чумы, сыпного тифа и т.д., — заносятся с током крови во внутренние ткани зубов (пульпу). ДНК этих возбудителей сохраняется в пульпе зубов после смерти заболевшего, причем, благодаря особенностям анатомического строения зубов, проникновение посторонних микроорганизмов в пульпу практически не происходит.

Для того, чтобы извлечь бактериальную ДНК из пульпы зубов, предложено несколько остроумных способов. Один из них состоит в том, что зуб извлекают из черепа, обрабатывают его поверхность антисептиком, заливают слоем стерильной резины (рис. 1а) для того, чтобы избежать контаминации (загрязнения) чужеродной ДНК на последующих этапах работы, разрезают верхушку зуба в стерильных условиях, чтобы открыть доступ к пульпе (рис. 1б и в), впрыскивают туда стерильной иглой раствор, который растворяет ДНК (рис. 1г), а затем помещают зуб в стерильную пробирку (рис. 1д) и центрифугируют на высокой скорости (рис. 1е) для того, чтобы содержащий ДНК раствор под действием центробежной силы перешел в пробирку. Количество полученной ДНК можно затем многократно увеличить, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [12].

В полимеразной цепной реакции используются уникальные одноцепочечные фрагменты ДНК (так называемые праймеры), которые позволяют распознать в изучаемой пробе и многократно увеличить количество (амплифицировать) только ДНК определенного вида микроорганизмов, — например, ДНК возбудителя чумы и никакую иную. Использование ПЦР для обнаружения микробной ДНК в ископаемых останках и археологическом материале позволило сделать множество совершенно удивительных открытий.

Так, например, установлено, что опустошительную эпидемию «Черной смерти», разразившуюся в Европе в середине XIV столетия, вызвали два штамма возбудителя чумы, которые были занесены независимо друг от друга и распространялись разными путями — первый с юга Европы на север, а второй — по побережью Балтийского и Северного морей, вызывая вспышки этой смертельной инфекции в ганзейских городах [3], [4].

ПЦР помогает также реконструировать исторические события: например, с использованием этого метода установлено, что осада города Дуэ французами во время войны за испанский престол (1710–1712 гг.) сопровождалась вспышкой сыпного тифа, возникшей, вероятно, вследствие заноса возбудителя этого заболевания — риккетсии — в Европу испанскими солдатами из Нового Света [5]. ДНК риккетсий обнаруживалась в пульпе зубов испанских солдат, массовые захоронения которых найдены в окрестностях этого города.

Впечатляющие результаты достигнуты благодаря палеомикробиологическим исследованиям в области изучения возбудителя туберкулёза. Турбекулез зачастую осложняется гематогенной диссеминацией возбудителя (т.е. распространением его через кровь) и поражением костей, — в частности, костей позвоночника. ДНК микобактерий туберкулёза может быть извлечена из пораженной костной ткани и использована для исследований. Кроме того, некоторые липидные факторы вирулентности микобактерий могут неплохо сохраняться в мумифицированных останках животных и человека, что позволяет подтверждать диагноз туберкулёза.

Выяснено, что туберкулезом страдали животные, на которых охотился первобытный человек — бизоны и мамонты [6]. Кроме того, очевидно, что туберкулёзом были поражены и первобытные люди, начиная с железного века. Возбудитель туберкулеза был обнаружен в костях людей из захоронения Аймырлыг на юге Сибири, датированного 2000 лет до н.э. [7], а также в костях детей из неолитической стоянки Атлит на территории современного Израиля, возраст которой определен в 9000 лет [8]. Учитывая, что поселение Атлит является самым древним из известных центров одомашнивания диких животных, не исключено, что первобытные люди заражались туберкулёзом от одомашненного крупного рогатого скота. ДНК микобактерий туберкулёза с большой частотой определялась в костях жителей Древнего Египта, начиная с 3500 лет до н.э.

Таким образом, туберкулез являлся частой инфекцией в древности. Однако ученых интересует вопрос о том, вызывали ли древние эпидемии те же варианты возбудителя, что и сейчас, или это были совершенно другие штаммы.

Применительно к возбудителю туберкулёза наибольший интерес вызывает происхождение штаммов генетического семейства Beijing (произносится как «Бэйджинг»), впервые выявленного в гистологических препаратах лёгочной ткани 1956–1990 гг. от больных из предместий Пекина. Штаммы этого генетического семейства являются наиболее контагиозными (т.е. заразными) и легче всего приобретают устойчивость к противотуберулезным препаратам, что делает весьма затруднительным лечение и ухудшает прогноз заболевания. Ответить на вопрос о происхождении штаммов Beijing помогают филогенетические исследования, основанные на анализе ДНК современных микобактерий туберкулеза, распространенных в различных географических регионах Земли в различных этнических группах.

Для изучения популяционной структуры микобактерий туберкулёза используются различные молекулярно-генетические методы. Одним из наиболее распространенных является метод MIRU—VNTR, основанный на обнаружении в ДНК микроорганизма специфических повторяющихся последовательностей — тандемных повторов. Родственные культуры возбудителя имеют совпадающее число тандемных повторов в специальных участках хромосомы (называемых MIRU—VNTR-локусами). На основании MIRU—VNTR метода можно изучить эволюционные отношения между отдельными штаммами, входящими в генетическое семейство Beijing и построить филогенетическое дерево, отражающее эволюционные связи между этими штаммами (подобное неукорененное дерево приведено на рис. 5).

Нетрудно заметить, что наиболее распространенным штаммом (генотипом) является генотип M11, который располагается в центре филогенетического дерева. Это, по-видимому, означает, что данный генотип является наиболее древним — родоначальником других штаммов. Если оценить современное географическое распространение этого штамма в Евразии, то окажется, что наиболее широко он распространен в Китае; при этом его доля убывает в направлении с востока на запад до северо-запада Российской Федерации. В то же время, в странах Западной Европы генотип M11 практически не встречается (рис. 6).

Размер диаграмм на рис. 6 приблизительно пропорционален доле штаммов Beijing в общей популяции M. tuberculosis. Цифрами обозначен индекс генетического разнообразия (чем ближе этот показатель к единице, тем более разнообразна популяция возбудителя туберкулёза) [9]. Данные, представленные на рисунках 5 и 6, позволяют предположить, что генетическое семейство Beijing сформировалось в Китае (поскольку наиболее древняя его ветвь преобладает именно в Северном Китае), а затем распространялось в западном направлении, что и обеспечило «градиент» частоты его встречаемости. Наиболее вероятной гипотезой, объясняющей распространение возбудителя туберкулёза в направлении с Востока на Запад, является миграция населения, произошедшая в историческом прошлом.

Но какая же миграция населения могла привести к распространению этого генетического семейства туберкулеза в Евразии? Поскольку Beijing не является эндемичным для Европы, можно исключить миграции, которые в равной степени затрагивали Россию и Европу, как источник исключительного проникновения штаммов Beijing в Россию. К таковым относятся финно-угорская, скифская, и гуннская экспансии [10]. Выдвинуто предположение [9], что проникновение штаммов Beijing в Россию могло быть связано с евразийской экспансией монгольской империи Чингисхана в 13–15 веках. Средневековая монгольская империя впервые в истории тесно связала отдаленные части евразийского суперконтинента и создала единую экономическую и культурную систему, охватывавшую огромное пространство Евразии. Связи монголо-татар с Русью были тесными и продолжительными (в отличие от контактов с европейцами), что, вероятно, и обеспечило укоренение на территории России штаммов генетического семейства Beijing.

Таким образом, изучение эволюции патогенных микроорганизмов во многом связано с изучением истории человечества, эпидемий, войн и вызванных ими миграций. Междисциплинарные исследования, использующие данные естественных и гуманитарных наук, позволяют глубже понять картину совместного сосуществования популяций микроорганизмов и человеческого общества.

Литература

1. L. H. Lambert, T. Cox, K. Mitchell, R. A. Rossello-Mora, C. Del Cueto, et. al.. (1998). Staphylococcus succinus sp. nov., isolated from Dominican amber. International Journal of Systematic Bacteriology. 48, 511-518;
2. Lam Tran-Hung, Ny Tran-Thi, Gérard Aboudharam, Didier Raoult, Michel Drancourt. (2007). A New Method to Extract Dental Pulp DNA: Application to Universal Detection of Bacteria. PLoS ONE. 2, e1062;
3. Stephanie Haensch, Raffaella Bianucci, Michel Signoli, Minoarisoa Rajerison, Michael Schultz, et. al.. (2010). Distinct Clones of Yersinia pestis Caused the Black Death. PLoS Pathog. 6, e1001134;
4. Это чума;
5. Tung Nguyen-Hieu, Gérard Aboudharam, Michel Signoli, Catherine Rigeade, Michel Drancourt, Didier Raoult. (2010). Evidence of a Louse-Borne Outbreak Involving Typhus in Douai, 1710-1712 during the War of Spanish Succession. PLoS ONE. 5, e15405;
6. Oona Y-C. Lee, Houdini H. T. Wu, Helen D. Donoghue, Mark Spigelman, Charles L. Greenblatt, et. al.. (2012). Mycobacterium tuberculosis Complex Lipid Virulence Factors Preserved in the 17,000-Year-Old Skeleton of an Extinct Bison, Bison antiquus. PLoS ONE. 7, e41923;
7. G. M. Taylor, E. Murphy, R. Hopkins, P. Rutland, Y. Chistov. (2007). First report of Mycobacterium bovis DNA in human remains from the Iron Age. Microbiology. 153, 1243-1249;
8. Israel Hershkovitz, Helen D. Donoghue, David E. Minnikin, Gurdyal S. Besra, Oona Y-C. Lee, et. al.. (2008). Detection and Molecular Characterization of 9000-Year-Old Mycobacterium tuberculosis from a Neolithic Settlement in the Eastern Mediterranean. PLoS ONE. 3, e3426;
9. Мокроусов И.В. Генетическое разнообразие и эволюция Mycobacterium tuberculosis: автореф. дис. ... док. мед. наук. — СПб., 2009;
10. P. A. UNDERHILL, G. PASSARINO, A. A. LIN, P. SHEN, M. MIRAZON LAHR, et. al.. (2001). The phylogeography of Y chromosome binary haplotypes and the origins of modern human populations. Ann Human Genet. 65, 43-62;
11. Сверим часы;
12. 12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция.