На этот раз всё очень серьезно. Искусственно созданную систему, которая может прицельно вносить изменения в участки генома, научили размножаться. Теперь из гетерозиготных мутантов могут получаться гомозиготные, то есть содержащие эту мутацию в обеих аллелях данного гена. Но самое главное — потомство таких организмов будет почти со 100-процентной вероятностью содержать такую же мутацию. Получается, что исследователи научились вносить изменения в геномы целых популяций! Как же это произошло и как работает?

У бактерий между повторами в CRISPR-кассетах содержатся спейсеры — уникальные участки ДНК, вырезанные когда-то из вторгнувшихся в клетку бактериофагов или плазмид и служащие одновременно «фотороботами» и проводниками CRISPR-ассоциированных (Cas-) белков для оперативного обезвреживания идентичных взломщиков*. При вторжении CRISPR-кассета экспрессируется, длинный транскрипт нарезается на короткие фрагменты (crРНК). Комплементарные соответствующим фрагментам нуклеиновых кислот преступника (протоспейсерам) crРНК «указывают» своим Cas-нуклеазам, кого надо резать. В одной из бактериальных CRISPR/Cas-систем уничтожителем чужеродной ДНК служит белок Cas9 [1].

* — Работа CRISPR/Cas-систем, рекрутированных биологами в качестве инструментов геномной инженерии, напоминает эукариотическую РНК-интерференцию и обеспечивает прокариотам этакий приобретенный иммунитет, о чём подробно рассказано в обзоре «CRISPR-системы: иммунизация прокариот» [2]. — Ред.

Удобство использования стрептококковой системы CRISPR/Cas9 в эукариотических организмах заключается в том, что нужно всего два компонента: «указывающая путь» молекула РНК — РНК-гид (guideRNA, gRNA), комплементарная целевому гену, и фермент Cas9, который расщепляет этот ген (рис. 1). Гены этих двух компонентов помещаются в плазмиду и доставляются в клетку, где должны экспрессироваться. Более того, методика позволяет доставить в клетку сразу несколько РНК-гидов, комплементарных разным генам-мишеням, и фермент Cas9 разрежет их все. Как правило, для инактивации того или иного гена достаточно внесения двунитевого разрыва. Дальше клеточные ферменты сшивают два конца ДНК, однако такая «починка» (репарация) оказывается неточной. Между «склеивающимися» концами ДНК могут ошибочно встроиться или удалиться отдельные нуклеотиды. В таком случае нарушается правильность «прочтения» транскрипта этого гена при трансляции — происходит сдвиг рамки считывания, изменяется аминокислотная последовательность, синтез белка обрывается на случайно возникающих стоп-кодонах. Такую «медвежью услугу» оказывает разновидность репарации, называемая негомологичным сшиванием концов ДНК (NHEJ, non-homologous end joining).

С помощью CRISPR/Cas9 можно не только нокаутировать ген, но и вставить любой новый участок ДНК вместо старого (например, заменить мутантный на нормальный). Для этого вместе с плазмидой, кодирующей CRISPR/Cas9, в клетку добавляется еще одна плазмида, содержащая ДНК-матрицу («заплатку»), которая будет вставлена при «починке» ДНК. В этом случае с помощью системы гомологичной рекомбинации происходит как бы «заштопывание по шаблону», и нужный ген или его часть оказываются встроенными в ДНК в нужном месте. Матрица для вставки ограничена (фланкирована) участками, комплементарными геномной ДНК с двух сторон от надреза. За счет рекомбинации комплементарных участков вставка матрицы происходит точно в место разреза (рис. 2).

Таким же образом в разрез можно вставить и саму кассету CRISPR/Cas9. Об этом сообщили ученые из Калифорнийского университета — Валентино Ганц (Valentino Gantz) и Этан Бьер (Ethan Bier) [4, 5].

Они «выключали» ген yellow, который отвечает за развитие нормальной окраски туловища — «в темную полосочку» — у Drosophila melanogaster, с помощью системы CRISPR/Cas9. Плазмида, вносящая эту систему в клетку, имела небольшое усовершенствование: кассета CRISPR/Cas9 была фланкирована длинными «плечами гомологии» — последовательностями, комплементарными хромосомной ДНК с двух сторон от предполагаемого разрыва. Такая хитрость позволила ученым не просто внести нокаутирующую мутацию в ген yellow, но и вставить в место разрыва саму кассету CRISPR/Cas9. РНК-гид и фермент Cas9 теперь экспрессировались участками ДНК в составе X-хромосомы и могли разрезáть соседнюю аллель и наследоваться (рис. 3).

Плазмиду вводили в эмбриональную клетку дрозофилы, из которой затем развивалась обладательница двух измененных аллелей гена yellow — особь с бледно-желтым телом (рис. 4). При скрещивании таких мух женского пола с носителями нормальных генов по менделевским законам наследования (в приложении к рецессивным мутациям в X-хромосоме) только 50% потомства (самцы) должны были родиться бледно-желтыми. Скрещивание самцов-мутантов с нормальными самками вообще не должно было привести к появлению «обесцвеченных» особей (рис. 5, слева). Каково же было удивление ученых, когда в первом случае почти все мухи (97%) были бледно-желтыми, а во втором — почти все самки (рис. 5, справа). Интегрированная кассета CRISPR/Cas9 по типу цепной реакции распространялась по геномам потомства: комплекс ее продуктов — Cas9 с РНК-гидом — упрямо разрезал полученные от другого родителя нормальные аллели гена yellow, и кассета встраивается в разрез путем гомологичной рекомбинации. Потому ученые и назвали разработанный метод мутагенной цепной реакцией, МЦР (рис. 6). Стоит отметить, что во втором поколении мух помимо бледно-желтых особей обнаружили нескольких особей с мозаичной окраской и нескольких — с окраской дикого типа (рис. 7).

Использование такого мощного инструмента может привести к изменению целых популяций живых организмов. Некоторые ученые (и, к слову, миллионы жителей тропиков) буквально мечтали об этом открытии, потому что оно позволит создать комаров, неспособных переносить малярию и лихорадку Денге. Другие рады, что теперь можно быстро выводить линии мышей со множественными мутациями для лабораторных исследований и не тратить время на тщательный скрининг [6]. А там недалеко и до генной терапии.

Однако у многих исследователей мутагенная цепная реакция вызывает большие опасения. Мутация, однажды введенная в геном единственного организма, неконтролируемо распространяется в геномах детей, внуков, правнуков и всех последующих поколений этой популяции. Муха с мутацией в гене yellow, случайно вылетевшая из лаборатории, может внести эту мутацию в природные популяции дрозофил — тогда все плодовые мушки на Земле со временем станут бледно-желтыми, а мы навсегда забудем, как выглядели раньше известные нам Drosophila melanogaster.

А если речь пойдет не о мухах, а о внесении мутаций, например, в геном человека?* Или экспериментаторы совершат ошибки, которые приведут к неконтролируемому распространению страшных патогенных организмов? Ученые успокаивают, что судьба нашей планеты не станет похожа на сюжет фантастического фильма. Они держат своих «бледных» дрозофил за семью печатями: посторонние не имеют доступа ни к пробиркам с плазмидами, ни к экспериментальным мухам. Они разделяют всеобщее волнение по поводу своего открытия, однако очень рады, что придумали такой эффективный метод редактирования генома. То ли еще будет!..

Литература

1. Hsu P.D., Lander E.S., Zhang F. (2014). Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262–1278;
2. CRISPR-системы: иммунизация прокариот;
3. Shao Y., Guan Y., Wang L., Qiu Z., Liu M., Chen Y. et al. (2014). CRISPR/Cas-mediated genome editing in the rat via direct injection of one-cell embryos. Nat. Protoc. 9, 2493–2512;
4. Gantz V., Bier E. (2015). The mutagenic chain reaction: A method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. doi: 10.1126/science.aaa5945;
5. Bohannon J. (2015). Biologists devise invasion plan for mutations. Science. 347, 1300;
6. Нобелевскую премию по физиологии или медицине вручили за технологию нокаутирования мышей;
7. Великий рекомбинатор;
8. А не замахнуться ли нам на... изменение генома?;
9. Lanphier E., Urnov F., Haecker S.E., Werner M., Smolenski J. (2015). Don’t edit the human germ line. Nature. 519 (7544);
10. Baltimore D., Berg P., Botchan M., Carroll D., Charo R.A., Church G. et al. (2015). A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification. Science. 348, 36–38;
11. Vogel G. (2015). Embryo engineering alarm. Science. 347, 1301..