Как правая и левая рука —
Твоя душа моей душе близка.
Мы смежны, блаженно и тепло,
Как правое и левое крыло.
Но вихрь встает — и бездна пролегла
От правого — до левого крыла!
Марина Цветаева

Эта история для меня началась с того, что мой коллега по Пущинскому научному центру, к.ф.-м.н. Азат Габдулхаков, занимающийся рентгеноструктурным анализом, рассказал об одной своей головоломке. Довелось ему сотрудничать с товарищами из Гамбургского университета для определения пространственной структуры комплекса белка и необычной молекулы РНК [1]. Белок был человеческим цитокином, а РНК создали на основе левой (!) рибозы. Такой комплекс оказался перспективной моделью для получения медицинских препаратов широкого спектра действия.

Меня удивила молекула РНК на основе левой рибозы — это очень эксклюзивная вещь. Какое вообще отношение химические вещества имеют к понятиям лево и право, рассказывает врезка «L- и D-стереоизомеры». К счастью, редко кто из нас задумывается, что природные белки и нуклеиновые кислоты состоят только из левых (L) аминокислот и правых (D) сахаров (см. врезку «Мистическая гомохиральность живого»).

Живые клетки предпочитают употреблять именно такие аминокислоты и сахара, используя их для построения жизненно важных клеточных структур. Белков, построенных только из правых аминокислот, равно как и нуклеиновых кислот, собранных из левых сахаров, в земных организмах не обнаружено. Откуда же взялась левая рибоза? И как такая молекула РНК взаимодействует с человеческим белком? Эти вопросы меня побудили  на независимое научное расследование и написание статьи о L- и D-стереоизомерах и прочих интересных вещах.

Дабы не запутаться во всех этих L и D, естественных и искусственных, я буду молекулы с несвойственной природе хиральностью выделять приставкой «ксено-» (от греч. ξενος, «чуждый»). К примеру, ксенонуклеиновые кислоты [3] образованы L-рибозой. А приставкой «био-» снабжу нуклеиновые кислоты и белки, построенные из преобладающих в живых существах мономеров — D-сахаров и L-аминокислот соответственно.

Теперь подробнее о комплексе человеческого белка и ксеноРНК.

Поиск стерео: научный подход

Человеческий цитокин под названием CCL2 служит «тревожным сигналом» для лейкоцитов — белых клеток крови, отвечающих за иммунитет, — и указывает им место, где требуется их вмешательство. В передаче сигнала принимают участие углеводы, называемые гликозаминогликанами. CCL2 воздействует на клетки посредством рецептора CCR2, сопряженного с G-белком, — о таких рецепторах уже немало сказано на «биомолекуле» [8], [9]. При этом цитокин CCL2 передает свой сигнал исключительно рецептору CCR2, но рецептор этот может принимать сигналы и от других цитокинов: CCL8, CCL7 и CCL13 [10]. У здорового человека этот отлаженный механизм обеспечивает активное долголетие: иммунитет работает четко, не доставляя никаких хлопот своему хозяину.

Однако род людской подвержен разным заболеваниям. И сейчас известны такие болезни, в которых повинен чрезмерно активный иммунитет. В частности, интенсивная атака на собственные клетки по непонятным причинам происходит при аутоиммунных заболеваниях, о чем рассказывает статья «Иммунитет: борьба с чужими и... своими» [11]. Сильный иммунитет также мешает при трансплантации органов, заставляя организм отторгать их. В терапии подобных недугов локальный защитник от пагубных нападок иммунитета был бы хорошим помощником. С такими защитниками имеет дело одно из самых современных направлений в медицине — антицитокиновая терапия.

Оказалось, что цитокин CCL2 и рецептор CCR2 играют определенную роль в иммунном ответе. В частности, активация сигнализации по этому пути влияет на течение воспалительных заболеваний, в том числе и аутоиммунных [12]. Поэтому белок CCL2 выбрали в качестве удобной мишени для блокирования этой сигнализации и приступили к поискам блокатора — локального защитника от ненужной активности иммунитета.

Путь поиска блокатора немецкие ученые, коллеги Азата, избрали нестандартный (рис. 2) [13]. Сначала они создали стереоизомер человеческого цитокина CCL2 и подобрали для него специфично связывающийся фрагмент биоРНК, который затем «вывернули наизнанку» — синтезировали его стереоизомер. Итоговый фрагмент ксеноРНК оказался эффективным ингибитором активности биоцитокина CCL2. Не пошла еще голова кругом? У меня — да.

До этого предпринимались попытки найти фрагменты биоРНК или биоДНК, специфически связывающиеся с биоцитокином, и использовать их для блокировки сигнала. Однако нуклеиновые кислоты на основе биосахаров легко распознаются ферментами и, соответственно, склонны к быстрой деградации в организме пациента [14]. Поэтому необычный подход с ксеноРНК дал надежду на успех.

Красивая идея, не правда ли?! Да и неординарность всей работы меня лично восхищает, поэтому далее хочу заострить ваше внимание на наиболее захватывающих моментах научного поиска.

Гомохиральность in cellulo и in vitro

Отмечу, что биосинтез белка возможен только из L-аминокислот, и это один из базовых биохимических процессов [15]. Биотехнологический синтез белка проводят либо непосредственно в клетке (например, в бактерии Escherichia coli), и тогда клеточный аппарат сам синтезирует вам из L-аминокислот столько нужного белка, сколько потребуется, либо в пробирке, для чего составляют специальную биосинтетическую смесь. В ее состав должны входить: 1) матричная РНК, кодирующая аминокислотную последовательность нужного белка; 2) исходный субстрат — левые аминокислоты; 3) энергетики — молекулы АТФ и ГТФ; 4) специально обработанный клеточный экстракт, в котором содержатся рибосомы и вспомогательные молекулы.

Все синтезированные белки будут точной копией друг друга: ошибки в биосинтезе белка — редкое явление. Несомненно, это огромный плюс для исследователей. При некоторой сноровке получение белка таким способом, конечно, занимает определенное время, но сейчас это стандартная задачка, с которой может справиться даже любознательный студент-биолог.

Другое дело — химический синтез белка. Его плюс в том, что в качестве субстрата можно использовать хоть D-, хоть L-аминокислоты, но минус — очень большая трудоемкость при невысокой точности. Поэтому исход процесса зависит от терпения и аккуратности химика-синтетика, то есть человеческий фактор играет значительную роль. Раньше химически синтезировали лишь небольшие пептиды — от двух до десяти аминокислот в цепочке. Сейчас уже можно собрать белок из трехсот и более аминокислот, но до сих пор это нетривиальная задача [16].

В случае с человеческим цитокином CCL2 мишень исследования оказалась в каком-то смысле удачной. Белок состоит всего из 66 аминокислотных остатков, но тем не менее в нём представлены все 20 разных аминокислот. Поэтому для создания ксенобелка исследователям пришлось последовательно, в определенном порядке, химически соединять 20 D-изомеров аминокислот. При этом на каждой стадии контролировать и отделять растущий пептид от молекул, синтезированных с ошибками. Экспериментаторы с этим справились. Далее оставалось лишь надеяться, что ксеноCCL2 сложится в нужную форму.

Сворачивание (фолдинг) белка до сих пор остается фундаментальной научной проблемой [17]. Правда, не буду лукавить, еще в прошлом столетии удалось показать, что, например, химически синтезированная из D-аминокислот ксенопротеаза ВИЧ-1 функционально активна [18]. Отмечу, что именно гомохиральность позволяет молекуле белка создавать функциональную структуру. Поэтому ВИЧ-1-ксенопротеаза специфично расщепляла D-пептиды и имела форму биопротеазы, но зеркально отраженную. Однако природа непредсказуема в своих проявлениях и с одинаковой легкостью рушит или поддерживает теории и хрупкие надежды ученых. С верой в то, что ксеноCCL2 похож на свой биологический стереоизомер, исследователи продолжали экспериментировать, и на следующем этапе использовали метод SELEX (см. врезку «SELEX: создай свой лиганд») для поиска специфично связывающегося фрагмента биоРНК.

В достаточно больших подробностях с представлениями о том, как белковые молекулы обретают свою форму, можно ознакомиться и на «биомолекуле»: «Проблема фолдинга белка» [19]. — Ред.

На работу потратили немало времени и сил, но аптамер из бионуклеотидов нашли. А дальше — стадия трудоемкого химического синтеза ксеноРНК.

Фрагмент биоРНК, с которым связался ксеноCCL2, состоял из 40 нуклеотидов. Конечно, здесь задача была чуть проще. В молекуле рибонуклеиновой кислоты всего четыре разновидности нуклеозидов: аденозин, гуанозин, уридин и цитидин. С помощью твердофазного синтеза ученые создали все четыре L-рибонуклеозида, а затем получили нужный 40-нуклеотидный ксеноРНК фрагмент [23]. В ходе эксперимента сделали необходимые контроли, и наконец наступил момент истины — связывание с человеческим биобелком CCL2. К всеобщей радости, контакт этих молекул оказался высокоспецифичным: К_D = 1,05 нМ [14].

Рентген, проницательный и беспощадный

Однако, чтобы детально понять процесс взаимодействия ксеноРНК и биобелка и воочию подтвердить факт их специфичного связывания, комплекс подвергли рентгеноструктурным исследованиям. На данном этапе подключили российского эксперта. Азат поведал следующее: «Коллегам посчастливилось найти специфический фрагмент L-РНК — это была их большая удача. Они получили кристаллы комплекса цитокина с L-РНК, что тоже невероятное везение. Эту L-РНК, кстати, назвали NOX-E36. Мне нужно было определить структуру и показать с помощью рентгеноструктурного анализа, что человеческий белок CCL2 сохраняет свою природную форму и действительно специфично связывается с NOX-E36. После трудоемких вычислений и длительного поиска нам удалось решить пространственную структуру этого необычного комплекса. Установить, что связывание происходит в месте взаимодействия цитокина с рецептором. Благодаря такому связыванию блокируется сигнал CCL2. Оказалось, что фрагмент ксеноРНК — потенциальный ингибитор и других цитокинов: CCL8, CCL11 и CCL13».

Во время рентгеноструктурного анализа были и свои приключения. Исследователи получили кристаллы в надежде, что это комплекс цитокина с NOX-E36. Поставили кристаллы в пучок рентгеновского луча, собрали дифракционные данные. Задачу решали кристаллографы испытанным методом молекулярного замещения, но решения не находили. Скрупулезная обработка полученных данных результатов не дала, и возникли сомнения. В элементарной ячейке кристалла было что-то, но что именно? Может, просто белок закристаллизовался, а может, это фрагмент ксеноРНК сформировал кристалл? Возможно, в кристалле вообще что-то ненужное!

Тогда решили прибегнуть к другому варианту экспериментов по кристаллизации, с использованием тяжелых атомов. И только с их помощью удалось получить детальную карту электронной плотности, которую должен был расшифровать кристаллограф. Здесь исследователей ждала удача: получилось определить, какие вещества составляли кристалл, и наконец-то найти что-то похожее на РНК. После полного вписывания атомов оказалось, что это и есть ксеноРНК. Обнаружили также дополнительные фрагменты электронной плотности и для белка. Так было доказано реальное существование комплекса биобелка CCL2 с ксеноРНК. Полученная карта электронной плотности отличалась высоким разрешением, а значит, описывала почти все детали молекул и их контакта (рис. 3).

На карте видны нуклеотиды, составляющие NOX-E36, и заметно, что они особенные. Понятно, как аминокислоты формируют α-спирали и β-тяжи в белке. Видны атомы, образующие нуклеотиды и аминокислотные остатки, и ясно, как они взаимодействуют. Однако на этом эксперимент не закончился. Более того, всё самое интересное только начиналось. Теперь на основе полученной структуры проводят анализ — ищут ответы на самые интригующие вопросы: как взаимодействуют ксеноРНК и цитокин, почему блокируется сигнал и как это можно использовать?

КсеноРНК — помощница

Представленная работа — плодотворный союз академической науки и фармацевтической фирмы Noxxon, поэтому параллельно с проверками качества полученного комплекса, ксеноРНК NOX-E36 проходила доклинические испытания на животных, которые оказались успешными. Молекулу сейчас проверяют в схемах иммуносупрессорной терапии, необходимой при трансплантации органов [24], [25]. Уже показана ее эффективность при лечении альбуминурии у людей, больных сахарным диабетом: идет вторая фаза клинических исследований [14], [26].

NOX-E36 — один из представителей шпигельмеров. Так назвали семейство молекул ксеноРНК — от немецкого spiegel, «зеркало» [14]. Разобранная здесь работа — лишь вершина айсберга. В частности, ксеноРНК NOX-A12 испытывают в борьбе с раком: идет вторая фаза клинических исследований, в которых участвуют пациенты с миеломой [27]. Кстати, и ксенопептиды не остаются в стороне. Их синтезируют и тоже тестируют в схемах лечения различных заболеваний [28].

Эра стереоизомеров подкрадывается незаметно. Однако перспективы, которые она открывает, заманчивы. Создание нового класса медицинских препаратов — это только начало. Вероятно, мы не сможем разгадать причину гомохиральности биосферы, но использовать эту особенность природы для нашего глобального прогресса реально уже сегодня.

Литература

1. Dominik Oberthür, John Achenbach, Azat Gabdulkhakov, Klaus Buchner, Christian Maasch, et. al.. (2015). Crystal structure of a mirror-image L-RNA aptamer (Spiegelmer) in complex with the natural L-protein target CCL2. Nat Comms. 6, 6923;
2. Пастер Л. Избранные труды (т. 1). М.: Изд-во АН СССР, 1960. С. 9–48;
3. Элементы: «Искусственные полимеры могут хранить генетическую информацию»;
4. D-аминокислоты: не только в Зазеркалье;
5. Bradley J. Honas, Urlene M. Glassman, Thomas J. Wiese. (2009). Enzymatic activity of α-L-fucosidase and L-fucokinase across vertebrate animal species. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 153, 359-364;
6. Твердислов В.А., Яковенко Л.В., Жаворонков А.А. (2007). Хиральность как проблема биохимической физики. Российский химический журнал. 1, 13–22;
7. David W. Deamer, Reay Dick, Wolfram Thiemann, Meir Shinitzky. (2007). Intrinsic asymmetries of amino acid enantiomers and their peptides: A possible role in the origin of biochirality. Chirality. 19, 751-763;
8. Зрительный родопсин — рецептор, реагирующий на свет;
9. Новый рубеж: получена пространственная структура β2-адренорецептора;
10. Samantha J. Allen, Susan E. Crown, Tracy M. Handel. (2007). Chemokine:Receptor Structure, Interactions, and Antagonism. Annu. Rev. Immunol.. 25, 787-820;
11. Иммунитет: борьба с чужими и… своими;
12. Satish L. Deshmane, Sergey Kremlev, Shohreh Amini, Bassel E. Sawaya. (2009). Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. Journal of Interferon & Cytokine Research. 29, 313-326;
13. Laure Yatime, Christian Maasch, Kai Hoehlig, Sven Klussmann, Gregers R. Andersen, Axel Vater. (2015). Structural basis for the targeting of complement anaphylatoxin C5a using a mixed L-RNA/L-DNA aptamer. Nat Comms. 6, 6481;
14. Axel Vater, Sven Klussmann. (2015). Turning mirror-image oligonucleotides into drugs: the evolution of Spiegelmer® therapeutics. Drug Discovery Today. 20, 147-155;
15. Рибосома за работой;
16. M. T. Weinstock, M. T. Jacobsen, M. S. Kay. (2014). Synthesis and folding of a mirror-image enzyme reveals ambidextrous chaperone activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 11679-11684;
17. Финкельштейн А.В. Введение в физику белка. Курс лекций;
18. R. Milton, S. Milton, S. Kent. (1992). Total chemical synthesis of a D-enzyme: the enantiomers of HIV-1 protease show reciprocal chiral substrate specificity [corrected]. Science. 256, 1445-1448;
19. Проблема фолдинга белка;
20. Мода на ретро. Где встречается обратная транскрипция, и как она эволюционировала;
21. Andrew D. Ellington, Jack W. Szostak. (1990). In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822;
22. C Tuerk, L Gold. (1990). Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510;
23. Stefanie Hoffmann, Johannes Hoos, Sven Klussmann, Stefan Vonhoff. (2011) RNA Aptamers and Spiegelmers: Synthesis, Purification, and Post-Synthetic PEG Conjugation;
24. A. Kalnins, M. N. Thomas, M. Andrassy, S. Müller, A. Wagner, et. al.. (2015). Spiegelmer Inhibition of MCP-1/CCR2 - Potential as an Adjunct Immunosuppressive Therapy in Transplantation. Scand J Immunol. 82, 102-109;
25. Mike Notohamiprodjo, Aivars Kalnins, Martin Andrassy, Manuel Kolb, Benjamin Ehle, et. al.. (2016). Multiparametric Functional MRI: A Tool to Uncover Subtle Changes following Allogeneic Renal Transplantation. PLoS ONE. 11, e0165532;
26. Menne J., Eulberg D., Beyer D., Baumann M., Saudek F., Valkusz Z. et al. (2017). C-C motif-ligand 2 inhibition with emapticap pegol (NOX-E36) in type 2 diabetic patients with albuminuria. Nephrol. Dial. Transplant. 32, 307–315;
27. H Ludwig, K Weisel, M T Petrucci, X Leleu, A M Cafro, et. al.. (2017). Olaptesed pegol, an anti-CXCL12/SDF-1 Spiegelmer, alone and with bortezomib–dexamethasone in relapsed/refractory multiple myeloma: a Phase IIa Study. Leukemia. 31, 997-1000;
28. Le Zhao, Wuyuan Lu. (2014). Mirror image proteins. Current Opinion in Chemical Biology. 22, 56-61.