Конкурс «био/мол/текст»-2017

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2017.

---

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

Спонсором приза зрительских симпатий и партнером номинации «Биомедицина сегодня и завтра» выступила фирма «Инвитро».

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Растительные ароматы давно и прочно вошли в человеческий обиход. Запахом любая смесь летучих веществ становится только тогда, когда воздействует на органы обоняния. Активно ведут исследования о способе, которым смесь химических веществ передает в мозг сигналы о характере запаха [1], [2], [3]. И хотя тайна запаха открыта еще не полностью, на практике человечество уже давно и широко использует растительные ароматы. Kосметика и парфюмерия, кулинария и бытовая химия эксплуатируют обонятельную способность человека и используют приятные для человеческого носа запахи, чтобы увеличить спрос на свою продукцию. Древние люди приписывали определенным запахам магическую или целебную силу, их использовали шаманы и жрецы. Сегодня ароматерапия из древнего искусства постепенно, но уверенно превращается в науку и внедряется в современную медицину [4]. Вкусовое восприятие пищи у человека на 90% зависит от обоняния [5]. Поэтому растения, обладающие приятным для человека запахом, пользуются спросом, и давно уже стали объектом пристального внимания ученых, которые пытаются разобраться и научиться управлять процессами биосинтеза летучих веществ.

Людям свойственно обращать внимание на аромат цветов, однако молекулы запаха синтезируются клетками, которые могут находиться не только в различных частях цветка и плода, но также и в листьях, корне и стебле. У многих растений из эпителиальных клеток развиваются трихомы — специализированные органы, синтезирующие и секретирующие различные вторичные метаболиты.

Что такое трихомы и какие они бывают

Трихомами (от греческого слова τριχωμα (trichōma) — волос) называют специализированные поверхностные органы или структуры, представляющие собой выступы на поверхности листьев, стеблей и других частей растения.

Большинство людей, в том числе и те, кто никогда не интересовался ботаникой, на самом деле близко знакомы с трихомами, хотя возможно и не подозревают об этом. В самом деле, найдется ли хотя бы один человек, которого никогда в жизни не жалила крапива, или такой, кому никогда не приходилось вытаскивать репейники из волос или шерсти домашних питомцев, или такой, кто никогда не ощущал запаха трав, таких как полынь, мята, базилик или орегано? И всё это — результат взаимодействия человека с трихомами растений.

Структура и внешний вид трихом могут быть весьма разнообразными, однако все они разделяются на две основные группы: несекретирующие (рис. 1а) и секретирующие (рис. 1б).

На одних растениях как секретирующие, так и несекретирующие трихомы соседствуют друг с другом, поверхность же других покрыта трихомами только одного типа. Встречаются также трихомы, специфичные для определенных частей растения, например длинные шелковистые волокна, покрывающие семена хлопка — это несекретирующие трихомы.

Мини-фабрики по производству запаха

Секретирующие трихомы способны синтезировать большие количества таких метаболитов, которые не синтезируются больше нигде в данном растении. Такие трихомы представляют собой фактически специализированные фабрики по производству вторичных метаболитов, к которым относятся и летучие вещества. Молекулы, которые мы воспринимаем как ароматы пряных трав: базилика, мяты, лаванды, орегано, тимьяна, синтезируются именно в секреторных трихомах, расположенных на стеблях и листьях (рис. 4).

Летучие вещества служат самим растениям для привлечения насекомых-опылителей. Многие из них синтезируются в ответ на повреждение растения и токсичны для патогенных бактерий, грибов и других вредителей. Известны также вещества, которые могут подавлять рост соседних растений. В плодах вторичные метаболиты играют роль консервантов и, кроме того, являются сигналом (вкус, цвет, запах) для животных, употребляющих данные плоды в пищу и осуществляющих таким образом распространение семян. Некоторые специфические вещества растения синтезируют в ответ на стресс — например, в условиях засухи или повышенного содержания в почве солей [7].

Чем интересны секретирующие трихомы? Прежде всего тем, что многие вторичные метаболиты, синтезируемые именно трихомами, оказались востребованы человеком (это относится не только к летучим компонентам!). Хотя секретирующие трихомы широко распространены в растительном царстве, на данный момент наиболее активно изучают биохимические процессы, происходящие в трихомах растений из двух семейств: паслёновых (к которым относятся помидоры, перцы, табак, картофель, баклажаны) и яснотковых, или губоцветных (к которым относятся пряные травы, например мята, базилик, розмарин и другие). Этот выбор продиктован не только тем, что эти растения представляют интерес для сельского хозяйства, но и тем, что для трихом паслёновых и губоцветных характерен широкий спектр синтезируемых вторичных метаболитов.

Многоклеточные секретирующие трихомы, которые имеют «ножку» (stalk, см. рисунок 1б б и г), легко собрать с растения и проанализировать их содержимое. Самый простой способ соскрести такие трихомы с поверхности — это заморозить стебли в жидком азоте, а затем сильно потрясти. При этом ножки трихом обламываются, а сами трихомы прилипают к стенкам пробирки. Так можно получить достаточно материала для изучения транскриптома, характерного для трихом, а также проанализировать их биохимический состав. Обычно клетки, из которых состоят трихомы, содержат очень мало или вообще не содержат хлорофилла. Анализ транскриптома трихом показал, что в их клетках активен только биосинтез тех первичных метаболитов, что представляют собой источник энергии и являются предшественниками тех вторичных метаболитов, на биосинтезе которых специализируются данные трихомы и которые чаще всего не синтезируются ни в каких других частях растения [8].

Химический состав запаха

Несмотря на все разнообразие растительных летучих веществ, по биохимическому строению большинство их можно отнести к нескольким основным группам: терпены, фенилпропаноиды/бензеноиды и производные жирных кислот.

Терпены

Терпены являются производными изопрена (C₅) и в зависимости от количества изопреновых звеньев подразделяются на С₁₀ моно-, С₂₀ ди- (гиббереллины), C₃₀ три- (прекурсоры стероидов), С₁₅ сескви- и С₄₀ тетратерпены (каротиноиды), а также политерпены, из которых состоит натуральная резина. Всего известно более 55 тыс. терпенов, более половины которых обнаружены в растениях. Не все терпены летучи, и в формировании запаха участвуют, в основном, моно-, ди- и сесквитерпены. Большинство растительных терпенов — вторичные метаболиты, но терпены гиббереллин и абсцизовая кислота — фитогормоны и относятся к первичным метаболитам. Предшественником всех растительных терпенов является изопентенилдифосфат (IPP, или DMAPP), который синтезируется как в цитоплазме, так и в пластидах (рис. 5).

Биосинтез различных летучих и нелетучих терпенов весьма характерен для трихом. Летучий монотерпен ментол синтезируется в секретирующих трихомах мяты (Mentha piperita) и придает мяте характерные мятные вкус и аромат. Чешуйчатые трихомы базилика способны синтезировать широкий спектр монотерпенов и сесквитерпенов. Однако в результате селекции базилика некоторые его сорта изменились настолько, что синтезируют всего один-единственный терпен. Лимонный базилик, например, выделяет гераниол, используя в качестве субстрата геранилдифосфат. Эта реакция катализируется гераниолсинтазой — ферментом, который относится к большому семейству моно-, сескви- и дитерпенсинтаз. Образовавшийся гераниол не просто накапливается в трихомах, но подвергается реакции окисления, а затем кетоенольной таутомеризации, в результате чего превращается в нераль. Смесь гераниола и нераля известна под название цитраль, и именно эта смесь придает данной разновидности базилика «лимонный» запах [8].

Фенилпропаноиды

Фенилпропаноиды (включая и бензеноиды) представляют собой производные аминокислоты фенилаланина и часто синтезируются и секретируются теми же трихомами, которые производят терпены. Например, многие виды базилика кроме терпенов синтезируют также летучие фенилпропаноиды хавикол и эвгенол; последний обладает «гвоздичным» запахом.

В трихомах часто находят и производные фенилпропаноидов, которые в результате модификации перестают быть летучими и секретируются на поверхность растения (например, агликоны флавоноидов найдены в трихомах перечной мяты) [8].

Производные жирных кислот

Эти вещества также выделяются секретирующими трихомами помидоров, табака, петунии и других растений семейства паслёновых, что делает стебли и листья этих растений липкими на ощупь и обеспечивает определенную защиту от насекомых-вредителей (именно эти производные жирных кислот летучими не являются!).

В качестве примера летучей молекулы с таким биохимическим строением можно привести монометил-насыщенную изовалериановую кислоту (3-метилбутановая кислота) СН₃—CH(СН₃)—СН₂—СООН, которая содержится в корне валерианы и вместе с другими компонентами отвечает за «валериановый запах» валерианы (но трихом у валерианы нет, так что за синтез вторичных метаболитов у валерианы отвечают другие клетки!)

Как собрать запах?

Для изучения химического состава запаха используют, в основном, различные хроматографические методы. Особенно часто применяют газовую или жидкостную хроматографии в сочетание с масс-спектрометрией.

Если в Древнем Египте для фиксации запаха использовали методы масляной экстракции, то в современном варианте в качестве растворителя используют спирт, хлороформ и некоторые другие органические вещества. Существенным недостатком полученного экстракта является то, что кроме пахучих веществ в него попадают другие соединения, причем в концентрациях, превышающих концентрации летучих веществ в десятки, а иногда и сотни раз. Анализ такой смеси хроматографическими методами — задача весьма трудная.

Чтобы определить состав запаха, хороши методы, позволяющие уловить и сконцентрировать именно легколетучие вещества — так называемый анализ свободного пространства. Так, например, метод твердофазной микроэкстракции (SPME) использует свойство некоторых полимеров поглощать запахи. Тонкий стержень из такого полимерного материала (рис. 6а и 6в) помещают в плотно закрытый сосуд вместе с растением и выдерживают 10–30 мин (желательно помещать в сосуд все растение, поскольку срезание листа или цветка является стрессом, и состав выделяемых веществ может измениться даже за короткое время инкубации). Затем стержень вынимают и помещают в инжектор хроматографической колонки, где нагревают до температуры 200–250 °С. При нагреве адсорбированные полимером молекулы высвобождаются и попадают в колонку, где тем или иным способом подвергаются фракционированию (рис. 6д). Метод этот хорош своей высокой чувствительностью, а также быстротой и простотой использования. Однако есть у него и определенные недостатки: из-за избирательности процесса адсорбции нельзя судить о количествах компонентов в анализируемой смеси; кроме того, на полимер могут адсорбироваться и совсем посторонние молекулы, например те, которые находились в помещении, где проводили анализ [9].

Название другого метода переводится с английского как «ловушка» (trapping). Метод заключается в том, что растение или какую-то его часть помещают в закрытый сосуд, через который с помощью насоса медленно прокачивают воздух (рис. 7). Подача воздуха осуществляют через фильтр. Запах адсорбируется на другом фильтре, который находится на выходе из сосуда. Для сбора запаха используют специальные полимеры. После окончания эксперимента полимер промывают растворителем (например гексаном) и таким образом получают «экстракт чистого запаха». Этот метод позволяет судить не только о качественном, но и о количественном составе запаха, а также сравнивать состав запахов, выделяемых одним и тем же растением в различные промежутки времени (например днем и ночью).

Генно-модифицированный запах — настоящее и будущее?

Польза и вред генетически модифицированных растений неоднократно обсуждались на «Биомолекуле» [12], [13], [14], [15]. Как наиболее эффективно использовать способность растений синтезировать уникальные вещества, летучие и нелетучие, которые, хотя и названы вторичными метаболитами, во многих случаях способны исполнять ведущую партию в пьесе о будущем человечества?

Человек модифицирует растения с тех самых пор, как впервые начал их культивировать. В сельском хозяйстве с незапамятных времен используют отбор и селекцию для выведения сортов с определенными свойствами. Однако зачастую улучшение коммерческих качеств плодов (размер, равномерное созревание, привлекательный цвет) или цветов (удлинение времени жизни при срезании) приводит к ухудшению вкуса и потере естественного запаха, что отрицательно сказывается на количестве потребителей.

Ухудшение вкуса и аромата поступающих на потребительский рынок помидоров оказалось настолько коммерчески важной проблемой, что на ее изучение было выделено весьма значительное финансирование. Ученые из семи научных лабораторий Америки, Китая и Израиля объединились для исследования причин, по которым в процессе селекции томатов значительно изменился их «профиль пахучих веществ». Провели сравнительный геномный анализ почти 400 различных сортов помидоров, а также их диких предков, и параллельно выявили химические компоненты, которые ассоциировались у людей с наиболее привлекательным запахом и вкусом. В результате этого широкомасштабного исследования появился список мутаций, меняющих вкус и запах помидоров. Из них около 20 достойны пристального внимания, и могут стать целями приложения селекционных усилий для создания ароматных и сладких помидоров [16], [17].

У многих декоративных цветов в процессе селекции пропал характерный для них аромат. Например, садовые розы (Rosa hybrida) обладают приятным запахом, химический состав которого включает весь спектр растительных летучих веществ: терпены, фенилпропаноиды и производные жирных кислот. Однако, большинство сортов, предназначенных для срезания и долго сохраняющие свежесть в виде букетов в вазе, практически утратили классический «розовый аромат». К сожалению, в этом случае розам повезло значительно меньше, чем помидорам, и для них не существует программы полного секвенирования генома, а также отсутствуют надежные методы трансформации, что значительно осложняет любые направленные манипуляции с геномом. В результате частичного секвенирования транскриптома роз удалось идентифицировать некоторое количество генов, кодирующих ферменты биосинтеза летучих веществ [18], [19]. Тем не менее до недавнего времени не было понятно, например, как именно в розах происходит биосинтез гераниола и других монотерпенов, которые представляют собой основную составляющую характерного для роз аромата, и только в 2015 году удалось проследить путь биосинтеза гераниола у роз [20]. Так что мечта о возвращении розам их чудесного запаха [9] до сих пор не осуществилась на практике, да и вообще трансгенных роз существует совсем мало (известна трансгенная голубая роза, в которую удалось вставить ген фиалки, ответственный за биосинтез дефинидина — антоцианина, придающего цветкам синий или фиолетовый цвет [21]).

Известны примеры успешного воздействия на состав запаха одних растений с использованием генов других растений. Сверхэкспрессия клубничной линалоол/неридолсинтазы в пластидах трансгенного арабидопсиса, позволила получить растение, выделяющее большое количество линалоола и таким образом отпугивающее вредителей архид (Mysus persicae) [11]. При избыточной экспрессии в петунии гена, клонированного из роз — ацетилтрансферазы (фермента, преобразующего спирт в ацетат), — изменилось содержание летучих ацетатов, выделяемых трансформированными растениями [22]. Существуют и случаи несколько непредвиденных превращений летучих молекул, при трансформации растений генами из растений с другим «молекулярным контекстом». Монотерпен линалоол образуется из изопрена под действием фермента линалоолмонотерпенсинтазы и является одним из важных компонентов запаха. Внедрение в геном петунии гена линалоолмонотерпенсинтазы из кларкии (Clarkia) не привело к изменению содержания линалоола, выделяемого трансгенным растением. Оказалось, что линалоол в петунии образуется, но претерпевает реакцию гликозилирования, а гликозилированный линалоол не является летучим [23]. В запахе гвоздики, трансформированной тем же геном, количество линалоола повысилось и составило 10% от общего количества выделяемых летучих веществ [24]. То же произошло и с геном сесквитерпенсинтазы гермакрена Д, клонированным из роз и трансформированным в петунию. В цветках петунии дикого типа присутствует природный гермакрен Д, что подтверждает наличие необходимого субстрата. Однако у трансформированных растений не обнаружили значимого увеличения концентрации выделяемого гермакрена Д [18].

Манипуляции с запахом могут послужить не только для непосредственного удовольствия человека в виде вкусных помидоров и ароматных цветов. Защиту сельскохозяйственных растений от вредителей можно будет в будущем поручить растениям со специально подобранным запахом. В ответ на появление вредителей некоторые растения выделяют смесь различных веществ, которая может состоять из более чем 200 различных компонентов. Эти вещества могут отравлять, отпугивать и сдерживать насекомых-вредителей, а также привлекать энтомофагов (насекомых, которые уничтожают вредителей). Эти данные позволяют надеяться, что воздействуя на спектр летучих соединений культивируемых растений, можно повысить их устойчивость к вредителям без использования дорогостоящих и экологически вредных пестицидов. Причем, вероятно, нет необходимости вводить гены, отвечающие за синтез молекул-реппелентов во всю популяцию культивируемых растений, поскольку именно при участии летучих молекул между растениями осуществляется передача информации, и появление защитных веществ у части растений вызывает соответствующий защитный ответ у соседних с ними особей (рис. 8) [7].

Но пока такие поля возможны только в мечтах. Из вышеприведенных примеров становится понятно, что воздействовать направленным образом на спектр выделяемых растением летучих веществ не так-то просто. Биосинтез каждого компонента запаха — многоступенчатый процесс, осуществляемый различными ферментами. И даже если удается добиться сверхэкспрессии генов, ответственных за выработку определенного летучего вещества, дальнейшая судьба каждой новой молекулы будет полностью зависеть от общего биохимического контекста растения-реципиента: вместо того, чтобы стать новым летучим компонентом запаха, она может стать субстратом для дальнейших превращений, потерять свою «летучесть» и превратиться во что-то совершенно другое.

Растения начинают и... выигрывают

В заключение хотелось бы привести один весьма показательный, на мой взгляд, пример, как растения «переиграли» микроорганизмы в борьбе за рынок сырья для фармацевтической промышленности.

В 2015 году половина Нобелевской премии по физиологии и медицине была присуждена китайской исследовательнице Юю Ту за разработку лекарства против малярии [25]. Работу по поиску веществ растительного происхождения, обладающих антималярийной активностью провели в Китае еще в 70-х годах 20 века, а к началу 21 века это вещество уже активно использовали для производства лекарственных препаратов против малярии. Вещество это — вторичный метаболит сесквитерпен артемизинин, синтезируется в трихомах растения Artemisia annua, которое является близким родственником нашей полыни. Уже к 2005 году стало понятно, что спрос на лекарства против малярии постоянно увеличивается, но при этом цена его должна оставаться стабильно низкой, поскольку низок и уровень жизни в тех странах, где оно наиболее необходимо. А значит, требуется бесперебойное обеспечение дешевым сырьем фармацевтических фабрик по производству этих препаратов. Казалось бы, наиболее экономически выгодным является синтетическоe и полусинтетическоe производство веществ в трансгенных микроорганизмах. Однако дальнейшее развитие событий доказало, что это не всегда так.

В 2010 году широко рекламировали «один из самых успешных проектов по применению метаболической инженерии — получение артемизинина — наиболее сильного противомалярийного средства» под руководством Джея Кислинга [26]. К 2013 году с использованием самых передовых методов синтетической биологии удалось довести производство артемизиновой кислоты до фантастически высокого значения — 20 г на литр культуры, после чего проект взял под контроль известный фармацевтический гигант Sanofi-Aventis. В проект вложили огромное количество средств. А в результате оказалось, что, несмотря на все усилия, стоимость синтетического артемизинина значительно превышает стоимость его растительного аналога, и в настоящий момент весь необходимый на рынке антималярийный препарат производят на основе растительного артемизинина [27], [28].

Использование растений в качестве биофабрик различных белковых продуктов уже упоминали в статье на «Биомолекуле» [29]. Похоже, что не менее перспективным станет и применение растений для эффективного и экологически безопасного синтеза целого ряда уникальных и полезных для людей веществ, которые называют «вторичными метаболитами растений».

Первая версия этой статьи опубликована в журнале «Биология» [9].

Литература

1. Майоров В. (2007). Восприятие запахов. «Наука и жизнь»;
2. Озерников В. (2013). Тайна запаха. «Познавайка»;
3. Эмур Д., Джонстон Д., Бубер М. (2016). Стереохимическая природа запаха. «Познавайка»;
4. Элементы: От обоняния рыб к восстановительной медицине;
5. Элементы: «Жизнь на грани». Глава из книги;
6. Han Liu, Shaobao Liu, Jiaojiao Jiao, Tian Jian Lu, Feng Xu. (2017). Trichomes as a natural biophysical barrier for plants and their bioinspired applications. Soft Matter. 13, 5096-5106;
7. Natalia Dudareva, Eran Pichersky. (2008). Metabolic engineering of plant volatiles. Current Opinion in Biotechnology. 19, 181-189;
8. Anthony L. Schilmiller, Robert L. Last, Eran Pichersky. (2008). Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant J. 54, 702-711;
9. Гутерман И. (2009). Возрождение запаха. «Биология»;
10. Trine Andersen, Federico Cozzi, Henrik Simonsen. (2015). Optimization of Biochemical Screening Methods for Volatile and Unstable Sesquiterpenoids Using HS-SPME-GC-MS. Chromatography. 2, 277-292;
11. A. Aharoni. (2003). Terpenoid Metabolism in Wild-Type and Transgenic Arabidopsis Plants. THE PLANT CELL ONLINE. 15, 2866-2884;
12. Цисгеномика: новое слово в селекции растений;
13. Игры в демиургов;
14. Еще раз про ГМО;
15. SciNat за январь 2017 #4: нейросеть-дерматолог, органы для мыши, выращенные в крысе, вкусные ГМО-помидоры;
16. Элементы: Генетики поняли, как вернуть помидорам вкус и запах, отнятые селекционерами;
17. Ершов А. (2017). Генетики нашли способ вернуть томатам былой аромат. N+1;
18. I. Guterman. (2002). Rose Scent: Genomics Approach to Discovering Novel Floral Fragrance-Related Genes. Unknown journal title.. 14, 2325-2338;
19. G. Scalliet, F. Piola, C. J. Douady, S. Rety, O. Raymond, et. al.. (2008). Scent evolution in Chinese roses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5927-5932;
20. J.-L. Magnard, A. Roccia, J.-C. Caissard, P. Vergne, P. Sun, et. al.. (2015). Biosynthesis of monoterpene scent compounds in roses. Science. 349, 81-83;
21. Y. Katsumoto, M. Fukuchi-Mizutani, Y. Fukui, F. Brugliera, T. A. Holton, et. al.. (2007). Engineering of the Rose Flavonoid Biosynthetic Pathway Successfully Generated Blue-Hued Flowers Accumulating Delphinidin. Plant and Cell Physiology. 48, 1589-1600;
22. Inna Guterman, Tania Masci, Xinlu Chen, Florence Negre, Eran Pichersky, et. al.. (2006). Generation of Phenylpropanoid Pathway-Derived Volatiles in Transgenic Plants: Rose Alcohol Acetyltransferase Produces Phenylethyl Acetate and Benzyl Acetate in Petunia Flowers. Plant Mol Biol. 60, 555-563;
23. Joost Lücker, Harro J. Bouwmeester, Wilfried Schwab, Jan Blaas, Linus H. W. Van Der Plas, Harrie A. Verhoeven. (2001). Expression of Clarkia S-linalool synthase in transgenic petunia plants results in the accumulation of S-linalyl-β-d-glucopyranoside. Unknown journal title.. 27, 315-324;
24. Lavy M., Zuker A., Lewinsohn E., Larkov O., Ravid U., Vainstein A., Weiss D. (2002). Linalool and linalool oxide production in transgenic carnation flowers expressing the Clarkia breweri linalool synthase gene. Molecular Breeding. 2, 103–111;
25. Названы лауреаты Нобелевской премии-2015 по физиологии и медицине;
26. C. J. Paddon, P. J. Westfall, D. J. Pitera, K. Benjamin, K. Fisher, et. al.. (2013). High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496, 528-532;
27. Alain Tissier. (2018). Plant secretory structures: more than just reaction bags. Current Opinion in Biotechnology. 49, 73-79;
28. Mark Peplow. (2016). Synthetic biology’s first malaria drug meets market resistance. Nature. 530, 389-390;
29. Растения-биофабрики.