Конкурс «Био/Мол/Текст»-2022/2023

Эта работа опубликована в номинации «Школьная» конкурса «Био/Мол/Текст»-2022/2023.

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Любое лекарство до применения на людях должно быть проверено на животных, чаще всего это мыши. А откуда берутся мыши для исследований, как и где их выращивают и какие сложности ждут лабораторную мышь на ее жизненном пути?

Представим, что в лаборатории города Н. разработали лекарство от... рахита, предположим... витамин Д-резистентного.

Витамин Д-резистентный, или гипофосфатемический рахит — достаточно редкое заболевание, которое развивается чаще всего в детском возрасте и проявляется в виде задержки роста, выраженных деформаций скелета, поражения других систем и органов. Без своевременного правильного лечения оно может привести к инвалидности. Традиционная терапия предполагает ежедневный прием лекарств в течение многих лет с обязательным врачебным контролем и лабораторными исследованиями, при этом она не всегда обеспечивает достаточный контроль над заболеванием и имеет побочные эффекты. В таких случаях прибегают к хирургическому лечению. В 2018 году в США разработали лекарство «Крисвита» (Burosumab) с использованием моноклональных антител. Однако это не решило проблему полностью, так как лекарство пока малодоступно, дорого и также требует регулярного приема [1], [2].

На практике есть несколько систем, применяемых для исследования эффективности и безопасности лекарства. В большинстве стран сейчас используют 5 фаз испытаний: доклиническая (проводят на животных), клинические дорегистрационные (3 фазы испытаний на группах людей) и клиническая пострегистрационная (проводят на всех пациентах, получающих лекарство после его регистрации) [3].

Иногда этап анкеты для заказа животных пропускают и заказывают их через электронную базу вивария (она есть в крупных вивариях, обладающих большим бюджетом — сайт электронной базы данных надо содержать и обслуживать).

Чаще всего основой для выведения новой линии мышей становились нелинейные (гетерозиготные) мыши с полезными, с точки зрения науки, спонтанными мутациями. В результате близкородственного скрещивания — инбридинга — такие мутации закреплялись и становились отличительным признаком конкретной линии, например, с предрасположенностью к возникновению того или иного заболевания. Линейные мыши предпочтительны для экспериментов в биологии и медицине. В пределах одной линии все мыши относительно генетически однородны — (в отличие от нелинейных); общие биологические признаки, отличающие линию от других, передаются из поколения в поколение. Какую бы особь из линии ни взяли для эксперимента, результат почти не будет искажен ее индивидуальными особенностями, и такой же эксперимент получится повторить в любом научном центре, т. е. результат будет сопоставим и воспроизводим [8].

В тех случаях, когда заболевание специфическое и в виварии нет подходящей линии мышей, ее могут создать с помощью различных методов, в том числе и изменив геном мыши с помощью технологии CRISPR-Cas9 [9]. Но на создание новых линий нужны время и средства.

В виварии единовременно содержат лишь небольшое количество мышей некоторых линий — строго под определенные эксперименты. Остальные линии мышей переносят на хранение в криобанк генетической лаборатории вивария в виде эмбрионов.

Эмбрионы криоконсервируют в пластиковых трубочках с запаянными концами, которые охлаждают в камере замораживания в несколько этапов до температуры —40 ^oС. Затем, после нескольких минут паузы, трубочки переносят в контейнер, который помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом (температура —196 ^oС) [11]. Для идентификации образцов их маркируют специальными криомаркерами и криоэтикетками, устойчивыми к низким температурам, а сами пластиковые трубочки могут отличаться по цвету.

После разморозки эмбрионы перед подсадкой в организм мыши некоторое время развиваются в пробирках с питательной средой до этапа бластулы.

Обычно количество мышат определяется плодовитостью мыши-мамы, к примеру, линейные мыши часто отличаются низкой плодовитостью. Именно поэтому в качестве суррогатной мамы для нашего заказа взят дикий тип мышей.

С момента подсадки эмбрионов в мышь дикого типа — и до ее полного восстановления после ухаживания за потомством — о ней заботятся с повышенной тщательностью. Сотрудники-лаборанты вивария ухаживают за ними, следят за ходом беременности, состоянием после родов, ростом и развитием потомства. Все это время о здоровье мышиных семей заботится ветеринар, имеющий большой опыт и знания в этой области.

От содержания животных и их статуса напрямую зависят результат и достоверность любого эксперимента. Виварии могут быть конвенциональные и SPF. В конвенциональных вивариях обычно содержат мышей нелинейных (гетерозиготных), неприхотливых к условиям. Мышей содержат в обычных клетках с ничем не прикрытыми решетками. При этом в виварии поддерживают стабильные условия: постоянную температуру, равномерное освещение, хорошую вентиляцию. Также соблюдают режим кормления, смены дня и ночи, обязательно регулируют шумовой фон, влажность, газовый состав воздуха. Регулярно меняют подстил и клетки (с последующей стерилизацией), строго в соответствии с графиком проводят различные варианты уборки помещений, УФ-обработку, а также, обычно раз в месяц — дезинфекцию, дезинсекцию и дератизацию. И все же, несмотря на такие условия содержания, конвенциональные мыши — это обычные здоровые особи, которые генетически неоднородны, могут быть потенциальными носителями различных микроорганизмов и патогенов, в связи с этим они пригодны не для всех опытов, а в основном для рутинных и кратковременных экспериментов.

Использование некоторых линейных лабораторных мышей позволяет получить достоверные и воспроизводимые результаты, что важно для многих серьезных медицинских и биологических экспериментов, таких как производство вакцин, исследования иммунитета, испытание новых лекарств и т.п. Однако они более капризны в содержании — для них необходимы особые виварии SPF (Specific pathogen free — свободные от видоспецифических патогенов). Здесь царит атмосфера полной стерильности, мышей содержат в клетках-изоляторах с индивидуальной системой вентиляции воздуха, весь персонал работает в стерильной одежде. Большое количество процессов автоматизировано, помещения надежно защищены от инфекций, в каждой стерильной комнате есть шлюз в специальный коридор для выноса материалов, например, загрязнившихся подстилов. SPF условия обеспечивают с помощью оборудования на технических этажах: парогенераторов, поддерживающих необходимую влажность, систем фильтрации и подачи воздуха, систем стерилизации воздуха (например, камеры с УФ-лампами и/или аппаратов повышающих давление до 30 Па) [10–12].

Наша заказанная в виварии города Н. героиня-мышь — трансгенная линия, она создана на заказ на основе линии BALB/c. Линия временно названа по предрасположенности к заболеванию «Рахит витамин Д-резистентный», но скоро получит свою уникальную аббревиатуру.

Поначалу названия линий появлялись в ходе работы и не были строго регламентированы. Так, линия DBA — первые выведенные более 100 лет назад инбредные мыши, — были названы по символам, кодирующим мутантные рецессивные гены dd, bb и аа. Одна из самых популярных линий — BALB/c, выведенная Х. Бэггом, в названии содержит фамилию ученого — Bagg и масть мыши — Albino (альбинос), она считается не раковой, эти мыши не агрессивны и имеют самый большой объем мозга относительно веса тела. Известная у исследователей линия C57BL/6, созданная генетиком К. Литтл, содержит в названии масть и индивидуальный номер животного — мышь № 57 Black, ее широко используют для исследований в генетике, иммунологии и производстве трансгенных мышей, несущих сегмент чужой ДНК. Линия NZB — новозеландские черные — содержит в названии сокращенное обозначение места выведения и масть. А вот для названия сублиний (линий, произошедших от общих предков, но поддерживаемых раздельно в разных лабораториях) правила при названии строго обязательны. Сублинии накапливают генетические различия и могут сильно биологически отличаться от исходной. Название сублинии состоит из названия основной линии, после которого, через косую черту, с заглавной буквы латинницей пишут дополнительное, образованное чаще от фамилии исследователя или названия лаборатории. Например, СВА/Са обозначает сублинию Картера (Carter) линии СВА. При передаче сублинии из одной лаборатории в другую, старый символ сохраняется и к нему добавляется новый. Например, CBA/CaLac обозначает сублинию Kaртера, поддерживаемую в английском Центре лабораторных животных (Lac). При наличии отличительного мутантного гена название будет сформировано из символа исходной линии, символа сублиний, следующего за ним дефиса и символа гена. Например, BALB/cY-wal означает, что сублиния имеет рецессивную мутацию (waved alopecia) [4], [5], [14].

Итак, помимо уже знакомой нам мыши (с витамин Д-резистентным рахитом), на стеллаже можно увидеть мышей разных линий. Кто же соседи героини нашего рассказа?

Вот мышь линии C57BL/6J-ob/ob — часть эксперимента самого вивария. Эту линию отличает моногенная аутосомно-рецессивная мутация в гене лептина на 6-й хромосоме, и ее используют для изучения метаболического синдрома и сахарного диабета [7].

Справа соседка-мышь из линии BALB/c Nude. У этих мышей нет шерсти, а также отсутствует тимус. Их иммунитет сильно ослаблен, и они меньше сопротивляются онкологии; на этой линии испытывают противораковые препараты [14]. Такие мышки содержатся исключительно в условиях SPF-вивария. На ее домике-клетке более мощный фильтр, а из-за нежной кожи этой мыши для нее, вместо обычных опилок, делают мягкую подстилку из початков кукурузы.

За условия содержания и здоровье мышей отвечают техники, лаборанты и ветеринары. Техники следят за состоянием оборудования, например, вентиляционных фильтров и автоматических поилок для мышей; лаборанты ухаживают за мышами (моют клетки, пересаживают, кормят); ветеринары проводят медицинские обследования. Здесь всегда помнят, что даже небольшие инфекции, не представляющие угрозу для жизни мышей, могут сильно повлиять на результаты исследований.

В некоторых вивариях вместо забора уже имеющихся у мышей эмбрионов проводят репродукцию in vitro. Это значит, что мыши не размножаются сами, а оплодотворение происходит пробирке.

А вот эмбрионы мышей дикого типа во многих вивариях не подвергаются криоконсервации и последующему хранению, а мышки проходят полноценный цикл беременности.

Комплекс для транспортировки лабораторных животных может быть выполнен в виде фургона либо быть полноценным автомобилем. Удивительно, но для самих мышей отведена только часть пространства (2). В отсеке для мышей установлены горизонтальные полки модульной стеллажной конструкции, на которых закреплены специальные транспортные коробки с лабораторными животными. Каждый модуль укомплектован амортизаторами для минимизации тряски. Сервисная камера (1) снабжена системами фильтрации, подогрева и охлаждения воздуха для бесперебойного поддержания заданного микроклимата, системой бесперебойного элекропитания и автоматической системой управления. Циркуляция воздуха происходит через воздуховоды (3) соединяющие отсеки. Такой комплекс обеспечивает возможность транспортировки животных SPF-статуса, их сохранность и снижение у них уровня стресса.

Когда состав лекарства позволяет, ученые стараются придать ему как можно более удобную для приема форму. Именно ее тестируют на животных.

Для определения результата исследования необходимы стандартизированные, специально разработанные тесты, соответствующие строгому протоколу, показывающие наличие и фазу заболевания у мыши, оценивающие безопасность и определяющие эффективную дозу лекарства [15].

Завершив испытания, ученые пишут статью, содержащую результаты исследования. Такие статьи публикуют в рецензируемых медицинских и биологических журналах.

Наша героиня родилась с дефектным геном, обусловившим болезнь — рахит витамин Д-резистентный. Но ей повезло. Опробованное на экспериментальной группе, в которой она была, лекарство дало прекрасный результат. Мышь выздоровела и празднует двухлетие, что для нее очень почтенный возраст.

В наше время доклинические исследования лекарств сложно представить без лабораторных животных: кроликов, хомяков, коз, свиней, мух дрозофил и даже улиток — и, разумеется, МЫШЕЙ.

Литература

1. Мальцев С.В., Сафина А.И., Михайлова Т.В. (2021). Гипофосфатемический рахит у детей — клинические и генетические аспекты, подходы к терапии. Практическая медицина. 19, 38–49;
2. Студеникин В. М. (2019). Неклассические рахиты у детей: витамин Д-зависимый и витамин Д-резистентный. Лечащий врач. 9, 34–37;
3. Путь к тысячам аптек начинается с одной молекулы;
4. Е.А. Gajdaj, D.S. Gajdaj. (2019). Genetic variety of laboratory mice and rats: history of occurrence, methods of obtaining and control. Lab Anim Sci Rus. 2;
5. Каркищенко В. Н., Шмидт Е. Ф., Брайцева Е. В. (2007). Исследователи предпочитают мышей BALB/c. Биомедицина. 6, 57–70;
6. H. M. Treshalina. (2017). Immunodeficient mice balb/c nude and modeling of various types of tumor growth for preclinical studies. Rossijskij bioterapevtičeskij žurnal. 16, 6-13;
7. M.A. Kovaleva, M.N. Makarova, V.G. Makarov. (2018). Review Of Genetically Modified Lines Of The Laboratory Animals Used As Model Metabolic Syndrome And Diabetes Mellitus Models. Lab Anim Sci Rus. 1;
8. Гудратов Н. О. (2004). Линейные мыши: достоинства и недостатки. Биомедицина. 4, 40–42;
9. Модельные организмы: грызуны;
10. М.А. Зайцева, Е.Г. Потапенко, Т.В. Кашина, А.Б. Верведа. (2020). Basic approaches to quality assurance of biological test systems in GLP-studies. Lab Anim Sci Rus. 3;
11. Котенкова Е. В., Мешкова Н. Н., Шутова М. И. О крысах и мышах. М.: «Наука», 1989. — 176 с.;
12. Болотских Л. А., Каркищенко В. Н., Каркищенко Н. Н., Семенов Х. Х., Касинская Н. В., Капанадзе Г. Д., Ревякин А. О., Матвеенко Е. Л. (2013). Создание лабораторных животных СПФ-статуса как основа экспериментальной медицины. Биомедицина. 4, 158–163;
13. N. V. Petrova, M. M. Skripkina. (2021). Maintenance and breeding of transgenic mouse strains at the scientific center of biomedical technologies of the FMBA of Russia. BIOMEDICINE. 17, 70-75;
14. Е.А. Gajdaj, D.S. Gajdaj. (2019). Genetic variety of laboratory mice and rats: history of occurrence, methods of obtaining and control. Lab Anim Sci Rus. 2;
15. От живого к неживому. Доклинические исследования сегодня и завтра.