Будущее доклинических исследований

Ни для кого не секрет, что биологические исследования и разработка лекарств — сложный и ответственный процесс. При этом в ходе отбора лучших молекул-кандидатов ученые должны заботиться не только о действенности, но и о безопасности новых препаратов. Так до того, как созданное лекарство получит человек, его изучают в других моделях: от компьютерных программ и клеточных культур до разных видов животных.

Спецпроект о доклинических исследованиях (доКИ) стал своеобразным приквелом к циклу статей о клинических испытаниях (КИ): что нужно сделать и изучить перед тем, как проводить клинические исследования с участием людей? Можно ли обойтись без экспериментов на животных? Почему правильные доКИ не менее значимы для разработки лекарства, чем КИ? Мы постараемся в доступной форме осветить сложные вопросы планирования и регулирования доклинических исследований; принципы этичности работы с лабораторными животными; узнаем, когда и чем можно их заменить; и заглянем в ближайшее будущее биомедицинской отрасли.

---

Независимый рецензент статьи — Равиль Ниязов, кандидат медицинских наук, специалист по разработке и регулированию лекарств в Центре научного консультирования, автор образовательного YouTube-канала PhED, а также ресурса по переводу на русский язык зарубежных документов по разработке и регулированию лекарств PharmAdvisor.

---

Партнер спецпроекта — российские аффилированные лица компании «Филип Моррис Интернэшнл», ФМИ (PMI Affiliates in Russia), которая активно ведет исследования в области биомедицины, системной биологии и биотехнологий.

Начать рассказ о доклинических исследованиях придется с принятой в отрасли терминологии, которая не лишена особенностей. С первой мы сталкиваемся сразу же, когда видим определение самих доклинических исследований (доКИ).

Доклиническое исследование

лекарственного препарата для медицинского применения — это исследование, субъектом которого является любой объект живого или неживого мира, за исключением целостного организма живого человека, и которое направлено на установление безопасности и эффективности такого лекарственного препарата у человека.

Говоря более простыми словами, цель доКИ — получение данных, которые позволят сделать выводы о возможном воздействии нового препарата на организм человека и обоснованно перейти к клиническим исследованиям с участием людей .

О том, как проводят клинические исследования лекарств (которые следуют за доКИ), подробно можно почитать в одноименном спецпроекте «Биомолекулы», например: «С миру по нитке: как соединились компоненты клинического исследования» [1].

Иногда можно встретить термин неклинические (non-clinical) исследования в контексте разговора о тех же доклинических (pre-clinical) испытаниях. И он даже лучше отражает суть: ведь некоторые такие исследования могут идти параллельно с клиническими, а не предшествовать им. Для упрощения и без того сложного материала в рамках этого спецпроекта мы будем обсуждать в основном доклинические исследования новых лекарственных средств (ЛС) , полученных методами химического синтеза и впервые выходящих на фармацевтический рынок. Тонкости доКИ биотехнологических продуктов, включая генные и клеточные терапии, заслуживают отдельной публикации.

На самом деле в доКИ участвуют еще не сами лекарства, а действующие вещества, их метаболиты, примеси и вспомогательные вещества, которые войдут в состав ЛС. Говоря «лекарство», «препарат» или «вещество», будем иметь в виду сразу все возможные объекты исследований.

Взглянем теперь на место доКИ в разработке новых препаратов (рис. 1). Здесь важно понять, что программа доклинической разработки может длиться от нескольких месяцев до нескольких лет, не уступая в сложности КИ, и очень дорого стоить. Однако по сравнению с клиническими исследованиями, стадия доКИ всё же примерно в 3 раза быстрее и в 8–10 раз дешевле.

Каковы же субъекты доКИ, если в них нельзя прибегать к помощи людей? В качестве моделей в доклинических разработках могут быть использованы компьютерные программы и базы данных, изолированные рецепторы и органеллы клеток, сами клетки (обычно в виде стандартизированных клеточных линий), ткани, органы и цельные живые лабораторные животные. Первая статья спецпроекта в основном будет посвящена работе с лабораторными животными как с наиболее «традиционной» моделью, от которой, тем не менее, хочется «уйти» в сторону более этичных способов получения необходимых данных. Пусть исследования in silico и in vitro имеют свои ограничения и пока не могут полностью заменить животные модели, развитие этих технологий в последние десятилетия позволило начать сокращать количество животных в доКИ, о чем мы расскажем в следующих статьях.

Напомним основные обозначения, пришедшие к нам из латыни: in silico означает компьютерное моделирование; in vitro — исследования на живых клетках, тканях и органах, но не на целостном организме; in vivo — исследования на живом животном. См. также: In vivo — in vitro — in silico [2].

Цели доклинических исследований

Основная идея доКИ — в обосновании целесообразности проведения последующих КИ, после которых новые вещества смогут войти в состав готовых продуктов. Пренебрежение доКИ чревато массой проблем. В лучшем случае будет потрачено очень много денег и времени на дальнейшие исследования неэффективного препарата. В худшем — участники КИ получат опасный для их здоровья препарат, что может привести к серьезным побочным эффектам и даже смерти.

У доклинических исследований существуют вполне определенные цели. Этичность доКИ с участием животных обеспечивается в том числе правильным планированием экспериментов — они должны быть направлены на получение необходимых данных. К целям доКИ относятся:

• проверка биологического действия (как полезного, так и токсического) различных веществ;
• определение биологически активных доз действующих веществ;
• выбор потенциальной стартовой дозы в будущих клинических исследованиях с участием добровольцев, определение диапазона безопасных доз и других параметров, необходимых для планирования КИ первой фазы;
• установление клинического пути введения и его безопасности;
• обоснование критериев отбора добровольцев/пациентов для включения в клинические исследования;
• определение физиологических параметров, подлежащих контролю в ходе клинического наблюдения с участием людей;
• выявление потенциальных рисков для здоровья не только пациентов, но и других людей (например, для населения в целом, ухаживающих лиц, членов семьи, близких и интимных контактов).

Виды доклинических исследований

ДоКИ можно разделить на разные типы в зависимости от целей, субъектов исследований и исследуемых параметров (табл. 1).

Поисковые и регуляторные исследования

По использованию получаемых результатов можно выделить поисковые (фундаментальные, трансляционные) и регуляторные (пилотные и опорные) исследования.

К поисковым, или нерегуляторным, исследованиям можно отнести всё, что помогает сформировать правильные гипотезы и цели для последующей разработки нового лекарства. Фундаментальные исследования во всём их многообразии изучают мишень для будущего лекарства. Они проводятся для изучения механизмов развития заболеваний, деталей биохимических взаимодействий в живых организмах и так далее. Такие исследования в основном проводят на клетках, а животных «подключают» для проверки гипотез, предварительно полученных in vitro. Трансляционные исследования изучают возможность какого-либо влияния на выбранную мишень с точки зрения лечения заболеваний, то есть являются первым «мостиком» для переноса научного знания в плоскость реального применения в медицине.

Важно отметить, что проведение поисковых исследований не урегулировано законодательно, т.е. нет строгих юридических требований в отношении используемых моделей, дизайна, размера выборки, оформления отчетов и т.д. Параметры исследований и модели определяются исключительно научными соображениями. Результаты этих исследований обычно не включаются в регистрационное досье, поскольку большинство из них касаются молекул-кандидатов, так и не доходящих до последующих этапов разработки. Задача поисковых исследований — найти несколько многообещающих кандидатов, которые можно было бы начать изучать в КИ.

После того, как разработчик по результатам поисковых клинических исследований приходит к выводу, что можно начать испытания с участием добровольцев, ему необходимо подготовить почву для проведения будущих экспериментов. Для этого инициируются регуляторные доКИ. Данное понятие предполагает, что существуют определенные юридически обязывающие критерии, которые должны быть выполнены при планировании, проведении, анализе, интерпретации и документальном оформлении таких исследований, поскольку на их основании впоследствии будет разрешаться изучение лекарства с участием людей.

Регуляторные исследования (пилотные и опорные) уже относятся к конкретному кандидату и изучению его действия, а их результаты влияют на получение последующих разрешений на КИ. Пилотные исследования проводятся для четкого определения параметров (например, дозы, режима дозирования, частоты введения, времени взятия образцов и др.) опорных исследований. Пилотными являются, например, работы с целью определения подходящих видов животных для последующих доКИ или же изучение диапазона токсических доз для выбранных животных.

Опорные исследования проводят, чтобы получить разрешение на КИ. Они уже отвечают на вопросы, заявленные в целях исследования, а их результаты включаются в регистрационное досье будущего препарата с целью обоснования проведения испытаний с участием добровольцев и регистрации средства.

Итак, строго регламентируются и контролируются только опорные доКИ, так как это, главным образом, исследования безопасности, необходимые для максимального снижения рисков для людей в КИ — об этом мы расскажем в соответствующем разделе ниже.

Фармакологические и токсикологические исследования

По изучаемым параметрам традиционно выделяют фармакологические и токсикологические исследования. Они могут проводиться в рамках как пилотных, так и опорных доКИ. Однако большой объем фармакологических исследований выполняется еще до начала регуляторной разработки, т.е. на поисковом этапе.

Фармакологические испытания нужны, чтобы изучить, как именно вещество будет воздействовать на человека или патогенные микроорганизмы и что происходит с целевым веществом после того, как оно попадет в организм. С другой стороны, токсикологические исследования подразумевают намеренное использование высоких доз исследуемого кандидата, заведомо превышающих предполагаемую терапевтическую дозу, для определения диапазонов его токсичности и ее конкретных проявлений (табл. 2).

В группе фармакологических исследований выделяют фармакодинамические и фармакокинетические исследования.

Фармакодинамика

раздел фармакологии, изучающий локализацию, механизм действия и фармакологические эффекты лекарственных средств, силу и длительность их действия. Иными словами, фармакодинамика отвечает на вопрос: «Как лекарство влияет на организм?»

Фармакокинетика

раздел фармакологии, изучающий кинетические закономерности химических и биологических процессов, происходящих с ЛС в организме (абсорбция, биораспределение, метаболизм, выведение). Таким образом, фармакокинетика отвечает на вопрос: «Как организм влияет на лекарство?»

Токсикологию, в свою очередь, делят на исследования общих, специфических видов токсичности, токсикокинетику, а также исследования экологической безопасности.

Фармакологические исследования: фармакодинамика и фармакокинетика

Разберемся чуть подробнее, из чего состоят фармакологические исследования.

Первая задача фармакодинамики — определить, является ли новое вещество эффективным. Для этого ученые в рамках тестов для оценки первичной фармакодинамики изучают, как препарат влияет на системы организма, на лечение которых он направлен.

Изучение вторичной, или второстепенной, фармакодинамики, напротив, дает информацию о том, как препарат действует на системы организма, в работу которых создатели средства изначально вмешиваться не стремились. И чаще всего, что ожидаемо, такое непредвиденное воздействие оказывается неблагоприятным. Здесь мы вплотную подходим ко второй цели фармакологических тестов — исследованию фармакологической безопасности, где оценивают негативные эффекты желательного фармакологического действия, если терапевтические дозы превышены. Это очень важное исследование, необходимое для последующей регистрации любого препарата, прошедшего доКИ. Более того, исследования фармакологической безопасности так же, как токсикологические исследования, строго регламентируются правилами надлежащей лабораторной практики GLP, о которых мы поговорим в следующем разделе .

Фармакологическая безопасность и токсикология — самая важная часть регуляторных доКИ: все эти испытания входят в так называемые доклинические исследования безопасности и нужны для того, чтобы снизить риски побочных эффектов от лекарств для будущих пациентов (в таблице 2 они выделены синим цветом). Если вещество впоследствии окажется просто неэффективным, это полбеды: тогда компания-разработчик просто не получит прибыль. А вот если оно окажется вредным для здоровья, расплачиваться будут люди — участники будущих исследований. Стремясь исключить возможность таких неприятных сюрпризов, ученые еще на стадии доКИ тщательно ищут и выявляют все нежелательные фармакодинамические свойства испытуемых веществ, анализируют эффекты, выявленные в токсикологических исследованиях (о них мы говорим ниже), и изучают, как и почему они проявляются. Если препарат подозревают в воздействии на какой-то определенный орган (сердце, мочеполовую или нервную системы), его работу изучают более подробно, проводя дополнительные тесты, если это требуется.

Во время исследования фармакодинамических взаимодействий определяют, как разные вещества влияют на работу друг друга: например, лекарство для лечения диабета может существенно изменять свойства противоопухолевого препарата.

А что насчет фармакокинетических исследований? Здесь ученые отслеживают судьбу действующего вещества с момента попадания его в организм и до полного выведения вещества и его метаболитов из организма. Для этого требуется определить биодоступность и способность препарата усваиваться (т.е. попадать в организм, например, после приема внутрь или нанесения на кожу); изучить его распределение в организме (в том числе узнать, достигает ли вещество молекулы-мишени или органов, на которые оно может оказывать токсический эффект); увидеть, как оно трансформируется и выводится. Фармакокинетические тесты делятся на исследования абсорбции, распределения, метаболизма, выведения и фармакокинетических лекарственных взаимодействий (табл. 2). Первые четыре параметра часто сокращают до аббревиатуры ADME (absorption, distribution, metabolism, and excretion). Роль фармакокинетики крайне велика, поскольку большинство испытуемых веществ обычно плохо всасываются или плохо распределяются по организму. Если планировать и проводить такие исследования грамотно, то можно отсечь значительное количество молекул-кандидатов уже на этом этапе, что позволит расходовать больше ресурсов на работу с действительно перспективными веществами.

Во время фармакологических испытаний животным вводят разные дозы препарата, а затем с определенными интервалами берут кровь, мочу и другие биологические жидкости, чтобы определить концентрацию в них лекарства и его метаболитов. Кроме того, нередко проводят исследования с лекарствами, мечеными радиоактивным изотопом. Для этого к исследуемому веществу добавляют радиоактивную метку и далее отслеживают его накопление в тех или иных органах и системах организма. Это позволяет — с помощью радиографического анализа — наглядно отследить, как быстро и сколько вещества попадает в организм, а также как оно распределяется по организму, в том числе количественно охарактеризовать преимущественное накопление в определенных органах и последующее выведение из них. Полученные данные дают возможность, среди прочего, спрогнозировать, каким способом стоит вводить препарат людям в КИ и через сколько времени он будет выводиться из организма.

Общая и специфическая токсичности, токсикокинетика

Классификация токсикологических исследований также представлена в таблице 2. Они делятся на исследования общих видов токсичности (то есть исследования, проводимые в отношении всех лекарственных препаратов) и исследования специфических видов токсичности. К общим видам токсичности относятся исследования общетоксических свойств, генотоксичности, канцерогенности, а также онтогенетической и репродуктивной токсичности (т.н. DART studies) (рис. 2).

В качестве примера доКИ, которое можно делать параллельно с КИ на добровольцах вплоть до второй фазы, можно привести исследования генотоксичности, но и тут есть нюансы. Изучение способности вещества вызывать изменения в генетическом материале in vitro с использованием бактерий в качестве субъекта исследования (тест Эймса) должно быть завершено только до начала I фазы КИ. Генотоксичность in vivo, в свою очередь, изучают параллельно с исследованиями на здоровых добровольцах до начала II фазы. Некоторые исключения могут быть сделаны, если в разработке находится препарат для детей, исследования которого на взрослых не проводятся — тогда весь комплекс исследований генотоксичности на животных придется завершить до начала исследований с участием детей.

Любая специфическая токсичность исследуется только в том случае, когда это необходимо. Например, если результаты изучения общей токсичности показали, что препарат может вызывать нежелательные реакции со стороны кожи (или же предполагается его наружное нанесение), нужно дополнительно исследовать фототоксичность — способность вещества снижать устойчивость клеток кожи к неблагоприятному воздействию солнечных лучей (рис. 3).

Отдельно стоит упомянуть токсикокинетические тесты, в ходе которых ученые определяют системную концентрацию ЛС у животных, участвующих в доКИ безопасности, или, иными словами, проводят оценку фармакокинетики вещества во время токсикологического исследования. Токсикокинетика призвана бороться с риском перепутать отсутствие токсичности с банальным недостижением у животных токсической концентрации исследуемого вещества. Недостижение токсической концентрации может быть связано с использованием животных разного пола, с путем введения вещества, его недостаточной абсорбцией, выраженным метаболизмом, высокой иммуногенностью (в случае биопрепарата) и другими факторами. Кроме того, токсикокинетика помогает удостовериться в биодоступности вещества и дает возможность увидеть зависимость выраженности токсических эффектов от содержания вещества-кандидата в организме. Этот анализ необходим практически во всех случаях опорных токсикологических исследований in vivo, и только после его завершения исследователи могут говорить о дозах вещества, которые станут стартовыми в КИ.

Экологическая безопасность

Требования многих зарубежных стран предусматривают проведение испытаний с целью подтвердить безопасность не только для человека, но и для окружающей среды в целом. Это необходимо для оценки последствий попадания нового препарата в биосферу. В некоторых случаях вред может быть значительным и требовать особых мер по утилизации.

Регламент и контроль доклинических исследований

В соответствии с общемировыми требованиями опорные токсикологические исследования и опорные исследования фармакологической безопасности (они входят в доКИ безопасности и являются стандартным комплексом исследований для всех новых молекул, которые войдут в состав лекарств) должны проводиться в соответствии с GLP. Все остальные фармакологические исследования, а также пилотные токсикологические исследования, могут проводиться без соответствия GLP, однако также должны быть хорошо стандартизированы, чтобы давать валидные результаты. Но что такое GLP? Почему исследования безопасности подвергаются дополнительному контролю? Какие еще есть ограничения и регламенты?

GLP расшифровывается как Good Laboratory Practice, или, по-русски, «Правила надлежащей лабораторной практики». GLP определяют методологию, уровень организации и проведения доклинических исследований и применимы не только в доклинических исследованиях потенциальных лекарственных препаратов, но и в разработке агрохимических, косметических средств, пищевых добавок, а также медицинских изделий, контактирующих с тканями человеческого организма. Международный стандарт, описывающий GLP, называется OECD Principles on Good Laboratory Practice и призван обеспечить взаимное признание результатов доКИ во всех странах-участницах OECD .

Некоторые компании, заинтересованные в проведении эффективных биомедицинских исследований, на основе международных стандартов разрабатывают собственные методологии, которые, как правило, содержат более широкие перечни требований. Примером может служить подход OECD+, который для своих экспериментов in vitro и in vivo сформировала команда PMI Science. В его основе лежит совместное применение стандартных методов токсикологической оценки и методов системной токсикологии, созданных в компании.

Кроме того, каждая страна имеет национальные документы, так или иначе соответствующие международным принципам проведения доКИ. В России это, например, ГОСТ 33044-2014, ГОСТ 33647-2015 и ряд других (перечислены в вышеобозначенных государственных стандартах), соответствующие приказы Минздрава РФ и Федеральный закон «Об обращении лекарственных средств» от 12.04.2010 №61-ФЗ, а также Правила надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств. Однако многие российские и евразийские ГОСТы и правила являются переводом документов OECD различной степени полноты и качества.

К сожалению, система обеспечения соблюдения норм GLP в России/ЕАЭС не полностью соответствует международной, что означает необходимость иностранных GLP-инспекций или повторения соответствующих исследований за рубежом (в том числе с этим столкнулись разработчики вакцины «Спутник V»), либо дополнительные сложности в процессе признания результатов испытаний новых препаратов.

Требования GLP в основном касаются качества и целостности данных с фокусом на воспроизводимость и стандартизацию протоколов, но не связаны напрямую с научными аспектами или вопросами гуманности и этичности. Научные аспекты, т.е. дизайн, объем и сроки исследований, материалы и методы, способы анализа и интерпретации регламентируются принимающими ведомствами — организациями, использующими результаты доКИ, которые должны проводиться в соответствии с GLP, для принятия собственных решений, например о выдаче разрешения на клиническое исследование или регистрацию. Наиболее известными организациями, вырабатывающими научные требования к проведению доКИ, являются:

• Международный совет по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных препаратов для медицинского применения (ICH);
• Организация экономического сотрудничества и развития (OECD);
• Управление по санитарному надзору за качеством продуктов и медикаментов США (FDA);
• Национальная токсикологическая программа США — подразделение в составе FDA (NTP);
• Европейское агентство лекарственных средств (EMA).

Эти организации составили множество руководств по доклиническим исследованиям, доступных на русском языке на портале PharmAdvisor. А об этичности исследований на животных мы поговорим чуть позже.

Как выбирают животных для доклинических исследований?

Итак, мы уже обмолвились, что наиболее значимую роль в доклинических исследованиях играет работа с лабораторными животными. Теперь пришло время обсудить, на какие факторы ученые опираются при выборе животных моделей для исследования новых лекарств.

Для понимания, что данные, полученные в ходе исследований на животных, далеко не всегда отражают, как вещество будет работать в человеческом организме, не нужно получать специального образования. Достаточно взглянуть на такие распространенные животные модели, как крыса и кролик. Между нами и этими пушистыми созданиями много сходств, но много и различий. И тем не менее эти виды млекопитающих помогают науке год за годом, «беря на себя» все риски, связанные с воздействием неизученных молекул, создаваемых людьми. Как же решить, какое животное лучше подойдет для конкретного исследования? Здесь нужно учитывать множество факторов, начиная с природы тестируемого вещества и предполагаемого механизма его действия и заканчивая поиском баланса между этичностью работы и нуждами исследователей.

Идеальная модель — это крыса?

Среди главных факторов, на которые приходится оглядываться, выбирая субъект исследования для доКИ, можно выделить его биологическое соответствие (релевантность), этичность работы с ним и возможность создавать модели для изучения определенных видов заболеваний.

В процессе доКИ важно как можно больше узнать о том, как новое вещество будет взаимодействовать с телом человека, и оценить потенциальные риски, связанные с приемом препарата людьми. Иными словами, выбранная животная модель должна давать возможность предсказать, как препарат поведет себя в КИ. Это значит, что ее фармакодинамические и фармакокинетические профили должны быть максимально приближены к человеческим. Вот почему исследования фармакологии и токсикологии лекарств проводятся исключительно на млекопитающих, а вот исследования экологической безопасности, если они требуются, могут включать работу с другими представителями хордовых и даже беспозвоночных.

Второй фактор — этичность — подразумевает, что ученые всегда должны думать о том, как обеспечить достойное содержание животных и снизить их количество без ущерба для качества процесса. Традиционно используемые в доКИ виды животных были когда-то выбраны не только из-за того, что они прекрасно подходили для поставленных задач, но и потому, что они способны переносить лабораторные условия. Не зря большинство исследований in vivo проводятся на мышах и крысах (рис. 4) .

В статье «Модельные организмы: грызуны» [3] мы рассказали о множестве заслуг наших маленьких собратьев перед человечеством. Читатель также благоволит ознакомиться с материалом «Грызун особого назначения» [4].

Грызуны удобны с точки зрения размножения и обращения с ними в процессе экспериментов. Эти животные достаточно мелкие, что позволяет использовать больше особей на единицу затрат: например, им не нужно вводить очень много препарата. Кроме того, их легко транспортировать.

Еще один плюс грызунов — относительная простота выведения специальных линий животных с определенным генетическим статусом, например мышей с «поломанными» генами, на которых удобно изучать какую-то конкретную болезнь. Существует множество линий трансгенных мышей для имитации разных болезней человека: гемофилий, болезни Гентингтона, ожирения, артериальной гипертензии. Так, мыши ApoE−/−, склонные к атеросклерозу из-за дефицита у них аполипопротеина E, активно используются учеными в ходе исследования сердечно-сосудистых и респираторных заболеваний (в том числе в ходе изучения влияния на организм сигаретного дыма), а FUS-TG F19-трансгенные мыши служат для изучения нейродегенеративных расстройств.

Несомненно, мыши и крысы хороши. Но современные требования к разработке лекарств требуют проводить исследования как на грызунах, так и на других млекопитающих. Почему? Давайте разбираться.

Два вида млекопитающих вместо одного для оценки токсичности

Несмотря на то, что в научном сообществе существует тренд сокращения количества используемых в экспериментах животных, официальные нормы часто требуют от исследователей тестирования новых веществ с привлечением двух видов млекопитающих, один из которых — негрызуны. Например, так обстоят дела при изучении общетоксических свойств новых молекул.

Дело в том, что грызуны не всегда позволяют получить полноценную картину того, как препарат будет действовать на человека. Работая с ними, ученые сталкиваются с выявлением как ложноположительной, так и ложноотрицательной токсичности. Конечно, привлечение дополнительных моделей не гарантирует 100% попадания, тем не менее комбинация из двух моделей (грызун + негрызун) лучше, чем одна. Она всё еще позволяет экономно расходовать ресурс и при этом статистически имеет больше шансов выявить потенциально негативное воздействие препарата на людей.

В качестве «негрызунов» часто используют собак. Однако иногда для работы могут не подойти ни крысы, ни собаки. Это может быть связано, например, с отсутствием у них в организме мишеней, на которые должно воздействовать исследуемое вещество, чтобы проявить свою терапевтическую активность. Такое нередко случается с изучением крупных молекул.

Исследования молекул больших и маленьких

Малые молекулы относятся к первому поколению лекарств и составляют порядка 90% всех лекарственных препаратов на рынке, включая многие безрецептурные препараты. Это низкомолекулярные вещества, которые быстро всасываются в кровоток и оказывают широкий спектр воздействий на организм, как положительных (запланированных), так и отрицательных. В ходе доКИ таких препаратов важно отслеживать зависимость доза—ответ для запланированных и незапланированных, нежелательных эффектов. Здесь прекрасно подходит двухвидовая модель, которая повышает вероятность выявления потенциальной токсичности вещества для человека.

Подробнее о том, как развивалась фармацевтическая отрасль, и какими бывают лекарства, читайте в статье «Три поколения лекарств» [7] на нашем сайте.

Иначе дела обстоят с биомолекулами, которых мы коснемся лишь очень кратко. Так называемые «биологические молекулы» (иначе biologicals — моноклональные антитела, факторы роста, ферменты, цитокины и др.), лежащие в основе биотерапевтических или биологических препаратов, имеют большой размер, а их воздействие часто очень специфичное — они прикрепляются и активируют только определенные рецепторы в организме. Из-за этого выбор животных моделей для них значительно затруднен и бывает ограничен, например, только нечеловекообразными приматами . Тогда двойная модель не используется. Для поиска подходящих видов животных для изучения больших молекул часто проводят предварительные испытания in vitro.

О том, какое место макаки и другие обезьяны занимают в современной науке, читайте в статье «Модельные организмы: приматы» [8].

Важное условие для исследования биотерапевтических лекарств заключается в том, что биологическая мишень молекулы должна быть одинаковой у человека и животной модели. Широко известный пример, когда игнорирование этого правила привело к провалу в разработке, связан с препаратом TGN1412 [9]. Это моноклональное антитело , связывающееся с рецепторами Т-клеток, которое предназначалось для лечения лейкоза и рассеянного склероза. До того, как ввести средство добровольцам, его испытывали на кроликах и макаках, причем вводимые макакам дозы в 500 раз превышали терапевтические для людей, но серьезных побочных эффектов выявлено не было. Проблемы начались в ходе клинических испытаний в 2006 году: уже после первого введения в первой фазе исследования у шести добровольцев развилась системная воспалительная реакция — «цитокиновый шторм». В одном из случаев это привело к развитию сепсиса и сухой гангрены. К счастью, все добровольцы выжили, но некоторым из них пришлось провести в больнице продолжительное время. Отличия рецепторов Т-клеток макак от человеческих оказались серьезной проблемой: разработку препарата прекратили.

Подробности о данном классе биофармацевтических средств мы сообщили ранее в материале «Терапевтические моноклональные антитела» [10].

Сколько животных нужно для предварительных и опорных доКИ

Предварительные исследования могут включать в себя определение различных параметров, но выборка и количество экспериментов на этом этапе обычно маленькие, потому что цель этих исследований — определить, стоит ли включать вещество в регуляторные доКИ, достаточно ли оно перспективно, и если да, то на каких видах животных целесообразно проводить эксперименты. Вследствие этого опорные тесты могут повторять уже проведенные предварительные исследования, но на большем количестве животных и более подробно. Для проведения одного исследования общетоксических свойств может понадобиться минимум 30 крыс (по пять грызунов каждого пола для каждой дозировки и контрольная группа) и несколько более крупных животных, например, собак [11]. Тогда как для выполнения полной батареи тестов исследований репродуктивной и онтогенетической токсичности на крысах в трех поколениях, в соответствии с действующими стандартами, потребуется участие около 3000 особей.

Имеет ли значение, насколько разными будут животные внутри группы? Спойлер: да!

Как получают и разводят лабораторных животных для исследований

Перед тем как решить, использовать ли однородных или разнородных животных, ученые взвешивают все плюсы и минусы каждого подхода. Если животные внутри группы похожи друг на друга, результаты экспериментов будут более согласованными, их вариабельность будет меньше. Но в то же время эти результаты нельзя будет распространять на другие группы. В целом для регуляторных исследований выбирают более разнородные группы животных — иногда это даже обязательное требование [12].

По степени однородности линии лабораторных животных делят на [13]:

• инбредные, или линейные (максимальная однородность, такие животные получены скрещиванием близкородственных особей — минимум 20 скрещиваний между братьями и сестрами);
• гибридные (получены скрещиванием инбредных линий, что позволяет выводить более здоровых животных);
• аутбредные (максимальная генетическая разнородность, как минимум четыре поколения животных разводят в закрытых популяциях).

Ранее мы также упоминали создание специальных трансгенных и нокаутных линий животных с измененным геномом. В ДНК первых ученые встраивают чужеродные гены, а у вторых искусственно выключают нужные участки ДНК-цепи.

«Качество» животных внутри линий тщательно контролируется, при этом ученые смотрят на определенные генетические маркеры, по которым можно понять, к какой линии относится та или иная особь [14]. Все животные, которые оказываются «испорченными» в результате случайных скрещиваний, уничтожаются. Чтобы отличить животных разных групп, можно использовать также тесты тканевой совместимости [15].

Выбор животного: каждый раз сначала

Выбрать животных для доКИ не так просто, как кажется на первый взгляд. Нередко исследователи новых лекарств раз за разом оказываются в сложной ситуации, когда имеющихся данных не хватает для того, чтобы качественно спланировать эксперимент. Всё же часто ученым помогает опыт их коллег (табл. 3) — чем больше экспериментов проводится, тем больше знаний накапливается, а это значит, что с каждым годом совершается всё меньше ошибок.

Этичность исследований на животных

Использование животных в доклинических исследованиях и научных разработках — сложный этический вопрос. Польза для человека имеет свою цену: страдания и гибель сотен тысяч животных.

Попыткой найти баланс между этикой и научным знанием при работе с животными является стратегия 3Rs — reduction, refinement and replacement of laboratory use of animals: уменьшение, усовершенствование и замена использования животных в лабораториях. Существует несколько подходов, которые в равной мере соответствуют принципам 3Rs.

1. Во-первых, чрезвычайно важно правильно спланировать исследование. Хорошо сформулированные гипотеза и эксперименты, минимально достаточная с точки зрения статистики выборка, следование нормам GLP и документирование всех результатов позволяют существенно сократить количество животных, вовлеченных в доКИ. Исследование, выполненное с учетом всех необходимых требований (таких как ослепление, рандомизация, корректные первичные и вторичные точки для последующего анализа, адекватный выбор вида животных и их количества), скорее всего, даст исследователям необходимые данные и будет принято регулятором (если оно опорное). Плохо проведенное исследование придется переделывать — а значит, использовать лишних животных. Это же касается несоответствия требованиям GLP: непризнание результатов уже проведенных доКИ в другой стране при выводе препарата на международный рынок может означать необходимость их повторения. Старая поговорка «семь раз отмерь, один отрежь» не теряет актуальности.
2. Во-вторых, ключевым вопросом является релевантность животной модели. Организм животных, как мы уже упоминали выше, отличается от человеческого, и многие системы работают иначе: кожа может иметь бóльшую или меньшую всасывающую способность, почти всегда отличается работа нервной и репродуктивной систем. Ряд ограничений объясняется изначально разными сроками жизни. Эксперименты, проведенные на нерелевантных моделях, приводят к результатам, которые нельзя экстраполировать на человека. В таком случае гибель животных в ходе доКИ может оказаться просто бесполезной — что может быть обиднее?
3. В-третьих, немаловажную роль играет содержание животных, обезболивание и гуманные методы эвтаназии. Жизнь подопытного кролика может стать лучше: в ряде стран локальные регуляторы и комиссии по биоэтике следят за размером клеток, наличием укрытия и игрушек, соблюдением правильной температуры и влажности. Улучшение условий содержания животных уменьшает их стресс, боль и дискомфорт в течение жизни. Делается это не только из заботы о подопытных. Плохие условия и стресс могут привести к неадекватным результатам из-за гормонального дисбаланса. Особые требования предъявляются к более социальным животным, таким как собаки или нечеловекообразные обезьяны — их нельзя содержать в клетках, только в вольерах, причем достаточно большого размера. Немаловажную роль играет квалификация специалистов, непосредственно контактирующих с животными.

Какие организации отвечают за этичность исследований с животными? Единого международного регулятора, к сожалению, пока нет. Но как правило в каждой научно-исследовательской организации, работающей с животными, присутствует биоэтическая комиссия. Также каждая страна имеет свое законодательство в области биоэтики и организации, следящие за его выполнением. В США это Institutional Animal Care and Use Committees (IACUCs). В странах ЕС существуют аналогичные локальные организации, но на уровне всего Евросоюза часть вопросов регламентируется EMA и входящими в ее состав комиссиями, а основные принципы соответствия подходу 3Rs при работе с животными прописаны в Европейской Фармакопее и Директиве 2010/63/EU. В 2014 году в России была основана Ассоциация специалистов по работе с лабораторными животными Rus-LASA, которая стала членом Федерации европейских ассоциаций по науке о лабораторных животных (FELASA) и Международного совета по науке о лабораторных животных (ICLAS).

Задача этих организаций — обеспечение правовых и этических норм по содержанию лабораторных животных, контроль за экспериментами, процедурами и состоянием помещений (в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологического и ветеринарного законодательства), а также рассмотрение предложений, жалоб и заявлений, касающихся содержания и использования лабораторных животных в научных и учебных целях.

К сожалению, наличие комитетов и ассоциаций не гарантирует стопроцентную этичность доКИ. Например, конвенция Совета Европы и Директива Евросоюза 210/63/EU устанавливают определенные этические принципы в отношении вреда, причиняемого охраняемым животным в исследованиях. Они затрагивают шаги, которые следует предпринимать для уменьшения боли, стресса и других страданий животных, включая применение принципа 3Rs; профессиональную подготовку персонала и качество вивариев; качество дизайна эксперимента. Но эти документы только в общих словах ограничивают цели, для которых могут быть использованы животные, и не содержат специфичных требований к биоэтической экспертизе. Этическую экспертизу, как было отмечено выше, обычно проводят локальные комиссии по биоэтике, и их требования разнятся в зависимости от страны и института или компании. Самым сложным вопросом является оценка соотношения «риск—польза»: точно ли такое исследование нужно проводить на животных?

Биоэтические комиссии оценивают не только планируемые доКИ, но и фундаментальные исследования на животных в научных центрах. Ученые в норме не могут и не должны претендовать на финансовую поддержку или начинать работу без одобрения комиссией по биоэтике специальной заявки на исследования с животными. К сожалению, несмотря на некоторые успехи, говорить о существовании развитого правового поля в сфере доКИ на животных в России пока рано. Основная роль отечественных комитетов по биоэтике остается формальной и сводится к почти автоматической выдаче научным коллективам документов, необходимых для продолжения исследований, без реального анализа планируемых экспериментов, их целесообразности и организации.

Будущее отрасли: кто, если не мышь?

Перед тем, как проводить доКИ на животных, вещества исследуют in vitro, то есть вне организма — как правило, сначала на изолированных рецепторах, а потом на клеточных культурах, которые могут быть как человеческими, так и животными. Это позволяет оценить связывание веществ с молекулами-мишенями на клетках и токсичность в простых условиях. Более того, на начальных этапах новые молекулы-кандидаты можно исследовать вообще вне живого, используя физические и химические тесты (например, для определения растворимости и липофильности) или специальные компьютерные программы. Последний подход называется in silico и служит для оценки потенциальной эффективности и токсичности веществ.

Для многих парадоксальной может показаться идея, что свойства реальных молекул реально исследовать в электронных «мозгах» компьютеров. Как это делается, предлагаем прочесть в статье «Биомолекулы»: «12 методов в картинках: “сухая” биология» [17].

Но можно ли совсем отказаться от животных, перейдя к исследованиям in vitro и in silico? К сожалению, пока нет. В случае оригинальных разработок получить разрешения регуляторов [18] и перейти к исследованиям с участием добровольцев без испытаний на лабораторных животных (in vivo) пока что практически невозможно. Животные не потребуются только в ряде случаев и лишь для некоторых тестов, например, если препарат был получен из плазмы крови или на основе клеток человека [19], а также если речь идет о дженериках или биоаналогах уже существующих средств, поскольку их действующие вещества уже были изучены ранее.

Большинство людей согласятся, что существующее положение вещей оправданно. Мы уже обсуждали, как важно выбрать правильную модель в доКИ, чтобы КИ были безопасными. Тем не менее тренд, предполагающий переход к более этичным методам исследования, продолжает набирать обороты, и альтернативные подходы к изучению свойств новых препаратов становятся всё более эффективными и просто реализуемыми. В следующих статьях спецпроекта мы еще коснемся новейших методик подробно, здесь же остановимся на них кратко.

In vitro: клетки в пробирке

In vitro-скрининг, где в качестве субъекта исследования выступает клеточная культура, выращенная в лаборатории, дает первичную информацию о возможных эффектах препарата на биологическую систему. Самый главный плюс такого испытания — возможность избежать трудностей, неразрывно связанных с использованием такой сложной системы, как живой организм.

Наиболее часто используемая модель in vitro — это монослой иммортализованной, или бессмертной, клеточной культуры (2D-культура). На нем удается получать воспроизводимые результаты, так как клетки в культуре унифицированы и способны делиться без ограничения и изменения своих свойств. Благодаря этому данные, полученные таким способом в разное время и даже в разных лабораториях, можно довольно легко сравнивать между собой. Однако они могут мало говорить о том, как препарат поведет себя в реальных клетках и тем более в организме животного или человека. Для получения более точной информации можно пользоваться первичными культурами клеток человека, т.е. взятых у здорового донора или пациента, однако с такими клетками сложнее работать.

1. Во-первых, они не унифицированные: между клетками от разных доноров различий может быть столько же, сколько между самими донорами, и реагировать на одно и то же вещество они могут по-разному.
2. Во-вторых, они имеют ограниченный срок жизни и пассажей, то есть количество экспериментов, которые можно провести с клетками одного донора, ограничено.
3. В-третьих, культивировать их сложнее — для этого, как правило, требуются более дорогие питательные среды и высококвалифицированные специалисты.
4. В-четвертых, для того чтобы использовать первичные клетки как модель, необходимо провести обширную работу по их характеристике [20].

Примером 2D-культуры могут служить иммортализованные клетки колоректального рака человека Caco-2 . Они используются для изучения абсорбции в кишечнике с конца 70-х годов прошлого века, моделируя кишечный барьер. В культуре они способны самопроизвольно дифференцироваться в энтероциты с плотными контактами и микроворсинками и синтезировать ферменты, переносящие лекарственные вещества (рис. 7) [21].

В статье «Модельные организмы: бонус — раковые клетки» [22] можно подробнее узнать, для чего и как они используются в научных целях. А в публикации «12 методов в картинках: клеточные технологии» [23] рассказывается, как именно исследователи работают с клетками.

Еще более приближенную к реальности картину дают трехмерные, или 3D-клеточные модели (рис. 8). Они лучше воспроизводят условия жизни клеток в организме — у них есть микроокружение из клеток-соседей и межклеточного матрикса. Это позволяет моделировать взаимодействие клеток разных типов, что важно, так как клетки в естественной среде обитания постоянно «переговариваются» между собой с помощью специальных сигнальных веществ, что невозможно в 2D-культуре.

Также 3D-модель обеспечивает наличие градиента концентрации вводимого вещества, то есть клетки снаружи получают больше лекарства, чем внутри культуры, как это и происходит внутри живого организма, особенно в твердых опухолях (рис. 9). Здесь виден эффект барьерных клеток, ведь в организме есть эпителиальная ткань, которая может значительно влиять на взаимодействие исследуемого вещества с клетками-мишенями. Благодаря всем этим факторам 3D-модель гораздо более информативна, чем 2D.

Конечно, у 3D-версии есть и минусы. Она более дорога, сложна и объемна, чем стандартный монослой клеток. Чтобы поддерживать такую культуру, нужно отдельно следить за распределением в ней питательных веществ и кислорода. Из-за сложности ее непросто адаптировать к высокопроизводительному скринингу, то есть процесс тестирования становится дороже, хотя компании активно работают над решением этого вопроса. Наконец, монослой — привычная для многих модель, которая хорошо описана в литературе, поэтому многие используют его по привычке.

Еще более продвинутой моделью являются «органы на чипе» (organs-on-a-chip), им будет посвящена отдельная статья спецпроекта. Здесь скажем лишь, что это устройство для выращивания клеточных культур, которое воспроизводит механические и физиологические условия в органах (рис. 10) или даже системах органов.

По своей сути это искусственные органы, ведь такая модель учитывает взаимодействие разных тканей, химический градиент веществ и механическую реакцию клеток на них (например, сужение сосудов). Предполагается, что в будущем этот подход позволит обойти тестирование на животных, и прецеденты уже есть: недавно ученым из Израиля удалось разработать новое лекарство от рака и провести доКИ без участия животных. При разработке ученые использовали чип, симулирующий человеческое тело. Этот чип содержит ткани человека и микроскопические сенсоры, чтобы отслеживать ответ человеческого организма — почек, печени и сердца — на препарат. Сейчас потенциальное лекарственное средство находится на стадии получения одобрения для КИ. Хотя этой идее уже 30 лет, израильская команда — первая, кто успешно заменил тестирование на животных исследованиями в искусственном органе. А сейчас настало время поговорить о «сухих» исследованиях — in silico.

In silico: организм внутри компьютера

В исследованиях in silico, чтобы оценить действие нового вещества на живые системы, используют компьютерные модели. Это позволяет сократить объем исследований in vitro и in vivo и удешевить весь процесс разработки.

С помощью подхода in silico можно подобрать молекулу под интересующий ученых сайт связывания (фрагмент биомолекулы-мишени, с которым должно связываться вводимое в организм вещество) и тестировать на животных только отобранных таким образом кандидатов. Этот подход называют драг-дизайном de novo [24].

«Биомолекула» не раз писала о применении подхода in silico к драг-дизайну. Для примера предлагаем обратиться к статьям «Драг-дизайн: как в современном мире создаются новые лекарства» [25], «Виртуальные тропы реальных лекарств» [26] и «12 методов в картинках: “сухая” биология» [17].

Существуют также методы, с помощью которых можно предсказать активность вещества и его механизм действия на основании химической структуры. Примером здесь выступает QSAR — Quantitative structure–activity relationship, количественная оценка зависимости «структура—активность». Этот метод представляет собой работу с математическими соотношениями, связывающими химические структуры и биологическую активность с использованием физико-химических свойств веществ. При этом во время расчетов свойство рассматривается как независимая, а биологическое действие — как зависимая переменная. Метод, к примеру, рекомендован для скрининговой оценки генотоксичности реактивных примесей, которые могут содержаться в лекарственных препаратах.

Компьютерное моделирование, сочетающее в себе методы классической токсикологии и системной биологии, — Quantitative Systems Pharmacology (QSP) — может, в свою очередь, предсказать механизм действия вещества, используя имеющиеся данные по препаратам, вышедшим на рынок и не прошедшим отбор. Также оно может предоставить полезные данные о дозах и режиме дозирования схожих средств, таким образом сужая диапазон исследований и уменьшая размер эксперимента, экономя деньги и время на дорогостоящих I и II фазах КИ. Подход системной токсикологии, используемый специалистами PMI Science для исследования воздействия аэрозолей на организм человека, включает в том числе компьютерное моделирование и методы вычислительной биологии, что позволяет получать релевантные результаты, работая с моделями биологических систем, имитирующих множество процессов, происходящих в живых тканях.

Математические модели фармакокинетики, основанной на физиологии (Physiologically based pharmacokinetic modeling, PBPK), широко используют для предсказания фармакокинетических свойств различных веществ. В этих моделях сотни дифференциальных уравнений описывают физиологические процессы, участвующие в распределении веществ по тканям и органам. Около 70% компаний в фармацевтической отрасли используют этот подход в рамках доКИ. Такое распространение стало возможным благодаря коммерчески доступным платформам PBPK и рекомендациям к их использованию от регуляторных агентств.

Следует сказать, что почти все описанные здесь модели in silico используют уже накопленные данные о веществах и их токсичности, поэтому инициативы, связанные с выкладыванием данных в общий доступ, поощряются, и существует множество подобных баз данных [27]. Например, проект Etox агрегирует данные по токсикологии, чтобы более точно предсказывать токсичность молекул in vivo. Исследователи могут свободно пользоваться этими данными для своих моделей. Компанией PMI, в свою очередь, была запущена инициатива INTERVALS — открытая онлайн-платформа для совместной работы с большими данными, которая призвана облегчать планирование новых экспериментов, например, используя уже полученные ранее результаты для проверки формулируемых вновь гипотез.

«Филип Моррис Интернэшнл» (PMI, или ФМИ) входит в число тех компаний, которые применяют инновационные методы исследований, альтернативные тестам на животных. В своих испытаниях ученые ФМИ основываются на практиках, уже много лет применяющихся в фармацевтической отрасли, а также используют все перечисленные выше методы — компьютерные модели, клеточные культуры и «органы на чипе».

Не конец, а начало пути

Перед тем, как вещество преодолеет путь от создания в лаборатории до применения (bench-to-bedside), его тщательно исследуют. В частности, на этапе доКИ ученым предстоит выяснить, стоит ли препарату вообще попадать в живой организм и какие побочные эффекты он может вызвать. Долгое время практически единственным способом получить такую информацию были животные — в наше время за год для исследований может быть использовано 9,39 млн лабораторных животных в одном лишь Евросоюзе. При этом большинство молекул-кандидатов вовсе не доходят до выпуска на рынок, ведь на любом этапе возможен провал и сворачивание проекта.

В ответ на существующие вызовы ученые изобретают всё больше новых способов подтвердить безопасность и эффективность новых веществ — in silico с помощью компьютерных моделей и in vitro на 3D-клеточных культурах и «органах на чипах». Возможно, мы еще застанем то время, когда для поиска лекарственного вещества не нужно будет причинять страдания ни одному животному, а все исследования будут проводиться на более близких к людям моделях.

Литература

1. С миру по нитке: как соединились компоненты клинического исследования;
2. In vivo — in vitro — in silico;
3. Модельные организмы: грызуны;
4. Грызун особого назначения;
5. Botting J.H. 18. The history of thalidomide. In: Animals and medicine. Cambridge, UK: Open Book Publishers, 2015. P. 183–198;
6. No role for thalidomide in leprosy. (2003). WHO;
7. Три поколения лекарств;
8. Модельные организмы: приматы;
9. Кинякина Е. (2019). Токсичная молекула: как сколковский стартап потратил полмиллиарда на лекарство с плохой историей. Forbes;
10. Терапевтические моноклональные антитела;
11. Nuria Tubau-Juni, Raquel Hontecillas, Marion Ehrich, Andrew Leber, Victoria Zoccoli-Rodriguez, Josep Bassaganya-Riera. (2018). Preclinical Studies: Efficacy and Safety. Accelerated Path to Cures. 25-40;
12. D.L. McCormick. (2017). Preclinical Evaluation of Carcinogenicity Using Standard-Bred and Genetically Engineered Rodent Models. A Comprehensive Guide to Toxicology in Nonclinical Drug Development. 273-292;
13. Katoh H. International harmonization of laboratory animals. In: Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. Washington (DC): National Academies Press (US), 2000;
14. Marjorie C. Strobel, Laura G. Reinholdt, Rachel D. Malcolm, Kathleen Pritchett-Corning. (2015). Genetic Monitoring of Laboratory Mice and Rats. Laboratory Animal Medicine. 1403-1416;
15. Е.А. Gajdaj, D.S. Gajdaj. (2019). Genetic variety of laboratory mice and rats: history of occurrence, methods of obtaining and control. Lab Anim Sci Rus. 2;
16. Miri Lee, Jee-Hyun Hwang, Kyung-Min Lim. (2017). Alternatives toIn VivoDraize Rabbit Eye and Skin Irritation Tests with a Focus on 3D Reconstructed Human Cornea-Like Epithelium and Epidermis Models. ToxicolRes. 33, 191-203;
17. 12 методов в картинках: «сухая» биология;
18. Gail A. Van Norman. (2020). Limitations of Animal Studies for Predicting Toxicity in Clinical Trials. JACC: Basic to Translational Science. 5, 387-397;
19. Expedited programs for regenerative medicine therapies for serious conditions. (2019). FDA;
20. Feiling Feng, Chuncui Huang, Mingjia Xiao, Huizhen Wang, Qingxiang Gao, et. al.. (2020). Establishment and characterization of patient-derived primary cell lines as preclinical models for gallbladder carcinoma. Transl Cancer Res TCR. 9, 1698-1710;
21. Tor Lea. (2015). Caco-2 Cell Line. The Impact of Food Bioactives on Health. 103-111;
22. Модельные организмы: бонус — раковые клетки;
23. 12 методов в картинках: клеточные технологии;
24. Thomas Fischer, Silvia Gazzola, Rainer Riedl. (2019). Approaching Target Selectivity by De Novo Drug Design. Expert Opinion on Drug Discovery. 14, 791-803;
25. Драг-дизайн: как в современном мире создаются новые лекарства;
26. Виртуальные тропы реальных лекарств;
27. Gopal Pawar, Judith C. Madden, David Ebbrell, James W. Firman, Mark T. D. Cronin. (2019). In Silico Toxicology Data Resources to Support Read-Across and (Q)SAR. Front. Pharmacol.. 10;
28. Justyna Szostak, Ee Tsin Wong, Bjoern Titz, Tom Lee, Sin Kei Wong, et. al.. (2020). A 6-month systems toxicology inhalation study in ApoE−/− mice demonstrates reduced cardiovascular effects of E-vapor aerosols compared with cigarette smoke. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318, H604-H631;
29. Pablo Meyer, Leonidas G Alexopoulos, Thomas Bonk, Andrea Califano, Carolyn R Cho, et. al.. (2011). Verification of systems biology research in the age of collaborative competition. Nat Biotechnol. 29, 811-815;
30. Ruth Dempsey, Christopher R.E. Coggins, Ewald Roemer. (2011). Toxicological assessment of cigarette ingredients. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 61, 119-128;
31. Diana Kuehn, Shoaib Majeed, Emmanuel Guedj, Remi Dulize, Karine Baumer, et. al.. (2015). Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke. JoVE;
32. Linda Gijzen, Diego Marescotti, Elisa Raineri, Arnaud Nicolas, Henriette L. Lanz, et. al.. (2020). An Intestine-on-a-Chip Model of Plug-and-Play Modularity to Study Inflammatory Processes. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 247263032092499.