Конкурс «био/мол/текст»-2014

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2014 в номинации «Биоинформатика и молекулярная эволюция».

---

Главный спонсор конкурса — дальновидная компания «Генотек».
Конкурс поддержан ОАО «РВК».

---

Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики.
Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.
Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.

Как найти археологическую сенсацию?

Не секрет, что главное и основное условие при работе с древней ДНК — это превосходная сохранность материала, которая может быть обеспечена комплексом условий. Поэтому на сегодняшний день наибольшее число научных работ по этой тематике основано на образцах, чей возраст не превышает пятидесяти тысяч лет, причем храниться они должны были в идеальных условиях — минимальной температуре и наименьшей влажности (рис. 1).

Условная фаланга пальца, обнаруженная археологом в условной пещере, как правило, лишь начало длинного пути к пониманию того, кем же был этот условный человек, и был ли он человеком в научном смысле этого слова. Причем, дабы не упрощать работу археологов, следует отметить, что на поиск условной фаланги может уйти не один десяток лет, в течение которого сотни практикантов будут просеивать тонны осадочной породы в поисках того, что сможет перевернуть современные представления о прошлом. Но мы не будем забегать настолько далеко, ведь после археологической работы с найденной фалангой предстоит плодотворно поработать еще двум группам людей (рис. 2).

Палеогенетики: спасение утопающих — дело рук самих утопающих

Вслед за археологами в работу включаются молекулярные биологи, которых в дальнейшем для простоты мы будем называть палеогенетиками. Пожалуй, и книги не хватит для того, чтобы описать те «муки», с которыми столкнутся последние. В помощь им — самые разнообразные ими самими (воистину, спасение утопающих — дело рук самих утопающих! — прим. автора) разработанные методики и подходы.

Первое, недолго думая, они «отобрали» у стоматологов их основное орудие труда. На начальной стадии при работе с костями или зубами биологи активно используют ненавистную с детства стоматологическую бормашину, которой они высверливают ткань, перетирая ее в муку.

Зубы оказываются действительно замечательным местом для исследования древней ДНК не только самого обладателя зуба, но и возможных находившихся в нем патогенных микроорганизмов (в том числе, ставших причиной гибели) [1], [2]. — Ред.

При этом их основной интерес вызывают некогда пронизанные кровеносными сосудами элементы ткани — сюда с меньшей вероятностью попадают различные бактерии, разрушающие организм после его смерти и, как правило, приводящие к контаминации (загрязнению) образца древней ДНК своими ДНК-фрагментами. Кроме того, туда не попадает ДНК современных людей, например, археологов и антропологов, описывающих находки. Несомненно, загрязнение современной ДНК мешает дальнейшему анализу: во-первых, при амплификации полимераза будет предпочтительнее «работать» с современными бактериальными молекулами ДНК, обходя стороной побитые временем фрагменты древней ДНК, а во-вторых, впоследствии вам придется фильтровать свои данные от всяких ненужных ни вам, ни высокорейтинговым журналам засоров.

Кроме «битвы» с контаминацией и борьбы за стерильные лабораторные условия, палеогенетики сталкиваются и с другими серьёзными проблемами. Например, с фрагментацией геномной и митохондриальной ДНК. Причем фрагменты в лучшем случае оказываются около 100 нуклеотидов. Мне встречалось немало людей, утверждавших, что их образцы обладают прекрасной сохранностью, но на деле они говорили о прекрасной сохранности современной ДНК, засорившей их образцы...

Следует отметить, что в некоторых случаях археологические останки действительно могут содержать десятки процентов эндогенной ДНК, но зачастую ученые вынуждены работать с долями процентов — плевелами среди куч современного «генетического мусора». Например, в костных останках денисовского человека было обнаружено примерно 70% эндогенной ДНК [3–5], а при анализе митохондриального генома новосвободненского человека этот показатель составил 0,006%, что говорит о диаметрально отличных условиях внешней среды, в которых находился археологический материал.

Естественно, 100 нуклеотидов — это ещё не повод «посыпать голову пеплом», ведь таких кусочков может быть тысячи и миллионы. Только следует помнить, что ДНК, как и любая биомолекула, способна вступать в химические реакции с окружающим миром, тут-то и появляются различные модификации нуклеотидов (особенно по краям фрагментов древней ДНК). Наиболее частая постмортальная мутация — дезаминирование цитозинов (C), приводящая к возникновению урацилов (U) в последовательности древней ДНК, которые при проведении ПЦР многократно копируются «бездушным» ферментом ДНК-полимеразой как тимин (T). Считается, что интенсивность процессов дезаминирования зависит от условий среды, в которой находятся биологические останки, например, от pH и химического состава почв, влажности и температуры. Под влиянием этих факторов фрагменты древней ДНК расплетаются по краям и отдаются во власть химической модификации.

Итак, фрагменты древней ДНК, с трудом и валидолом выделенные из условной фаланги условного человека, попадают в пробирку, где над ними продолжают «колдовать» палеогенетики. Эти крохи генетической информации, этот «привет из прошлого» подготавливается для дальнейшего секвенирования (установления первичной последовательности ДНК) . Для этой цели используют современные приборы — секвенаторы, позволяющие прочитать и обработать громадный массив геномной информации за сравнительно небольшой отрезок времени.

«Биомолекула» уже многократно рассказывала про успехи и методы секвенирования: «Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии» [6], «Огурцы-убийцы, или как встретились Джим Уотсон и Гордон Мур» [7], «Код жизни: прочесть не значит понять» [8], «454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК)» [9]. — Ред.

Как хорошо уметь считать!

После запуска этих машин и получения первичных, «сырых» данных палеогенетики молитвенно складывают руки, ожидая результатов, которые будут получены группой людей, объединенных специальностью биоинформатика [10], [11]. Именно биоинформатики являются последним звеном при работе с древней ДНК, извлеченной из археологического или палеонтологического материала.

Между нами, эта их особенность дает им уверенность в своем превосходстве над остальными звеньями научного эксперимента, что часто ведет к торможению многих блестящих научных проектов. Однако с этим приходится мириться, поскольку современная популяционная генетика невозможна без использования биоинформатических методов, и на Западе это десятки людей, связанных одной целью. Обработка данных секвенирования древней ДНК — не самое тривиальное занятие: несмотря на значительные усилия, в данных по-прежнему остается большой процент современной ДНК, а также неидентифицируемого генетического мусора, который нуждается в тщательной очистке, с привлечением математического аппарата. Удивительно, но именно постмортальные модификации нуклеотидных последовательностей древней ДНК и небольшая длина выделенных из биологического материала ДНК-фрагментов служат превосходным маркером при работе с древней ДНК, позволяя отфильтровать весь современный генетический мусор [12] (рис. 3).

Фактически фильтрация данных древней ДНК — наиболее важная часть биоинформатической работы: именно на этой стадии отсекаются все те последовательности, которые впоследствии могут привести к научной ошибке. Далее следуют стандартные этапы по определению митохондриальных гаплогрупп, Y-хромосомных гаплотипов, поиску древних геномных мутаций и даже сборке нового генома (например, используя уже известные геномы современных людей в качестве «каркаса»).

Древние перспективы

Идеальные случаи, связанные с превосходной сохранностью археологического материала, приводят к тому, что условная фаланга пальца или бедренная кость, найденные где-то в Сибири, становятся прорывом в понимании истории человечества, заставляющим пересмотреть всю его историю или даже опровергнуть казавшуюся незыблемой теорию его происхождения.

Такие находки и такие исследования приводят к появлению не только великолепных научных публикаций, но и позволяют зародить надежду на возрождение прошлого. Увы, современные естественнонаучные методы позволяют лишь приподнять занавесь древней истории нашей планеты, но воскресить его вряд ли смогут.

Post Scriptum

К сожалению, в России подобные исследования находятся в зачаточном состоянии. Только несколько лабораторий пытаются работать с отечественным палеонтологическим и археологическим материалом, который подобно углеводородам уходит за рубеж. В 2014 году сотрудники Центра «Биоинженерия» РАН и НИЦ «Курчатовский институт» впервые в России отсеквенировали последовательность митохондриальной ДНК (и определили её гаплогруппу) у древнего человека, обитавшего на территории Северного Кавказа в эпоху ранней бронзы [12], [13]. Эта пионерская для России работа, возможно, даст толчок отечественной археологической и палеогенетике.

Литература

1. Мамонты, кости и лекарственная устойчивость: новые технологии позволяют изучать эволюцию возбудителей инфекционных заболеваний;
2. Это чума;
3. M. Meyer, M. Kircher, M.-T. Gansauge, H. Li, F. Racimo, et. al.. (2012). A High-Coverage Genome Sequence from an Archaic Denisovan Individual. Science. 338, 222-226;
4. Kay Prüfer, Fernando Racimo, Nick Patterson, Flora Jay, Sriram Sankararaman, et. al.. (2014). The complete genome sequence of a Neanderthal from the Altai Mountains. Nature. 505, 43-49;
5. Qiaomei Fu, Heng Li, Priya Moorjani, Flora Jay, Sergey M. Slepchenko, et. al.. (2014). Genome sequence of a 45,000-year-old modern human from western Siberia. Nature. 514, 445-449;
6. Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии;
7. Огурцы-убийцы, или Как встретились Джим Уотсон и Гордон Мур;
8. Код жизни: прочесть не значит понять;
9. 454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК);
10. Я б в биоинформатики пошёл, пусть меня научат!;
11. Вычислительное будущее биологии;
12. A. V. Nedoluzhko, E. S. Boulygina, A. S. Sokolov, S. V. Tsygankova, N. M. Gruzdeva, et. al.. (2014). Analysis of the Mitochondrial Genome of a Novosvobodnaya Culture Representative using Next-Generation Sequencing and Its Relation to the Funnel Beaker Culture. Acta Naturae. 6, 31-35;
13. Недолужко А. (2014). Путешествие в Денисову пещеру. «Квакша».