Мир рибонуклеиновых кислот удивительно богат: есть в нём и крупные молекулы, несущие информацию о структуре белков, и малые, регулирующие синтез этих самых белков, и те, что входят в состав рибосом и ферментов или даже сами, без белковой помощи выполняют ферментативные функции [1]. Удивительно разнообразны не только функции, но и пространственные структуры этих молекул — причудливые сочетания петель, шпилек, псевдоузлов и т.п. [2]. В этом молекулярном калейдоскопе затерялся особый, слабо изученный класс РНК — молекулы, ковалентно замкнутые в кольцо. Впервые кольцевые РНК обнаружили еще в 1979 году, однако тогда они не привлекли к себе должного внимания и были приняты всего-навсего за побочные продукты сплайсинга, не наделенные какими-то особыми клеточными ролями. Однако недавно выяснилось, что не так уж и просты эти колечки: многие из них выполняют регуляторные функции и даже причастны к серьезным проблемам со здоровьем. Откуда же берутся эти загадочные молекулы и как они работают?

Как транскрипт может превратиться в кольцо?

Теоретически кольцевую РНК (англ. circular RNA, circRNA) можно получить тремя разными способами.

Во-первых, в ходе сплайсинга [3] интроны удаляются из созревающего транскрипта не в виде линейного фрагмента, а в виде лассо. Если от этого лассо отрезать «хвост», то получится кольцевая РНК. Такие интронные кольцевые молекулы накапливаются преимущественно в ядре и обозначаются ciRNA (circular intronic long non-coding RNAs) [4].

Во-вторых, в созревающем транскрипте отдельные экзоны могут выпетливаться, и такие петли могут вырезаться сплайсосомой и ковалентно замыкаться в кольцо. Так образуются кольцевые РНК, состоящие только из одного экзона. Кольцевые РНК, которые состоят исключительно из экзонов — одного или нескольких, — объединяют в группу ecircRNA (exonic circRNAs) и обычно находят в цитоплазме [4].

В-третьих, выпетливаться может участок, содержащий несколько интронов и экзонов. При вырезании и замыкании сплайсосомой такой петли формируются кольцевые РНК, содержащие и экзоны, и интроны. Они локализуются преимущественно в ядре и обозначаются EIciRNA (exon-intron circRNAs). Эти молекулы могут продолжить сплайсироваться, и после удаления интронов из них получатся кольцевые РНК, состоящие из нескольких экзонов (рис. 1) [4].

Процесс вырезания сплайсосомой выпетливающихся участков транскрипта называется бэксплайсингом (англ. backsplicing). За счет чего происходит такое выпетливание?

1. Зачастую интроны, окружающие один экзон, содержат комплементарные друг другу инвертированные повторы, которые, образуя водородные связи, формируют «стебелек» петли (рис. 2).
2. Выпетливание может происходить при участии специальных белков: два мономера такого белка связываются с двумя концами будущей петли, димеризуются и сближают концы так, что сплайсосома может ковалентно сшить их. Пока известны три белка, регулирующих образование некоторых кольцевых РНК: Quaking (QKI), Muscleblind (Mbl/MBNL1—3) и Fusedinsarcoma (FUS). Так, Muscleblind регулирует образование circRNA своего же гена, связываясь с особыми участками в интронах незрелого транскрипта (рис. 3).

Кроме того, образование кольцевых РНК зависит от белков, которые связываются с незрелой мРНК в сайтах вырезания кольцевых РНК, делая их недоступными для сплайсосомы.

Обобщая, можно сказать, что биогенез кольцевых РНК — это сложный процесс, регулируемый комбинацией многих факторов, в том числе расположением инвертированных повторов и взаимодействием с белками, которые опосредуют выпетливание или, напротив, делают бэксплайсинг невозможным [4].

Интересно, что у некоторых архей образование рибосомных РНК (рРНК) протекает через стадию кольцевой молекулы-предшественницы, которая далее нарезается на отдельные рРНК [5].

Кругооборот кольцевых РНК

Лишенные свободных концов, кольцевые РНК не по зубам ферментам-экзонуклеазам, которые разрушают многие транскрипты упорным отщеплением концевых нуклеотидов. В связи с этим средняя кольцевая РНК более стабильна, чем линейная мРНК: circRNA живет 19–24 часа (иногда до 48 часов), что в 2–5 (а то и в 10) раз превышает возможности линейных молекул. Однако как же всё-таки разрушаются кольцевые РНК?

Существует несколько гипотез на этот счет.

1. Кольцевые РНК могут расщеплять эндонуклеазы, которые разрушают нуклеиновые кислоты не с концов, а «вгрызаются» во внутренние части молекулы. Вероятно, в этом случае за разрушение отвечает комплекс, содержащий микроРНК, «наводящие» эндонуклеазы группы Argonauteна молекулы-мишени [1], [6].
2. В circRNA, подлежащих разрушению, некоторые аденозины могут специфически метилироваться. Такие метилированные РНК распознаются особыми белками, переносящими их в места деградации рибонуклеиновых кислот — так называемые Р-тельца.
3. В разрушении circRNA могут быть задействованы особые органеллы — аутофагосомы, среди прочего содержащие эндонуклеазы [7].
4. Клетки могут выбрасывать излишние circRNA в кровь в составе мембранных пузырьков — внеклеточных везикул.

Если для первого гипотетического пути разрушения кольцевых РНК есть некоторые экспериментальные подтверждения, то остальные модели еще ожидают своей проверки опытом [4].

Функции кольцевых РНК

Описаны биологические эффекты как самих кольцевых РНК, так и процесса их образования. Кроме того, кольцевые РНК могут кодировать пептиды, которые тоже выполняют определенные клеточные функции.

Хотя бэксплайсинг, приводящий к образованию circRNA, — событие в 100 раз более редкое, чем обычный линейный сплайсинг, вполне вероятно, что эти два процесса конкурируют друг с другом и взаимоподавляются. Возможно, именно подавление линейного сплайсинга в ходе формирования кольцевых РНК — основная клеточная функция этих удивительных молекул. Выпетливание участка незрелого транскрипта за счет комплементарного связывания инвертированных повторов в интронах само по себе может эффективно подавлять линейный сплайсинг. Кроме того, для протекания как бэксплайсинга, так и линейного сплайсинга необходимы одни и те же участки транскрипта; обычно они задействованы именно в линейном процессе, что в большинстве случаев подавляет бэксплайсинг. Действительно, показано, что с одного и того же гена кольцевые РНК и обычные линейные мРНК не синтезируются одновременно. Однако экспериментальные данные свидетельствуют о более сложной, чем обычное конкурентное подавление, связи между линейным и бэксплайсингом. Как бы то ни было, какие-то факторы должны определять, что будет считываться с гена в данный момент — кольцевая РНК или мРНК? Возможно, важную роль в этом решении играет скорость транскрипции. Так, альтернативный сплайсинг часто приводит к образованию лассо, содержащих интроны (то есть возможных предшественников кольцевых РНК), а это нередко происходит при ускорении транскрипции [4].

Выбор между бэксплайсингом и линейным сплайсингом может быть основан и на более сложных механизмах. Предполагают, например, что кольцевая РНК, которая считывается с гена mbl, забирает на себя весь белковый продукт этого гена — Muscleblind. Известно, что этот белок необходим для образования линейных mbl-мРНК, поэтому, связываясь с ним и не давая ему функционировать, кольцевые mbl-РНК (circMbl) подавляют синтез своих линейных «собратьев» (рис. 3).

Не исключена и возможность комплементарного связывания кольцевых РНК с участками породивших их генов, то есть с ДНК [4].

Ряд экспериментов свидетельствует в пользу того, что EIciRNA (экзон-интронные) и ciRNA (интронные) влияют на транскрипцию своих собственных генов, стимулируя РНК-полимеразу II. Исследователям удалось осадить с помощью антител комплекс EIciRNA с РНК-полимеразой II, причем выяснилось, что для стимуляции полимеразы необходим еще один компонент — малая ядерная РНК U1. Возможно, при взаимодействии с EIciRNA U1 располагается таким образом, что стимулирует работу полимеразы. А вот ciRNA, похоже, могут связываться непосредственно с хроматином в области «родительских» генов и повышать скорость их транскрипции. Удалось осадить, например, ciRNA под названием ci-ankrd52 в комплексе с активно работающей РНК-полимеразой II (активная форма фермента отличается особым фосфорилированием С-концевого домена). Поскольку ciRNA способны связываться и с «чужими» последовательностями ДНК, их роль в контроле экспрессии генов может быть значительной [4].

Для двух ecircRNA (экзонных, локализованных в цитоплазме) экспериментально показана способность влиять на синтез белка. Кольцевая РНК circANRIL нарушает работу комплекса белков, процессирующих рРНК, уменьшая тем самым количество функциональных рибосом и выход белка. А circPABPN1 подавляет работу белка HuR, необходимого для трансляции ряда мРНК [4].

Кольцевые РНК могут служить структурной основой для сборки белковых комплексов и тем самым обеспечивать межбелковые взаимодействия. Например, благодаря circ-Foxo3 циклинзависимая киназа 2 (Cdk2) взаимодействует со своим ингибитором, p21, что приводит к остановке клеточного цикла. А еще кольцевые РНК могут секвестрировать белки — ограничивать их перемещение к рабочим местам. Так, вышеупомянутая circ-Foxo3 может «запирать» в цитоплазме транскрипционный фактор E2F1 и некоторые другие белки [5].

Но секвестрированием белков дело не ограничивается. Некоторые экзонные кольцевые РНК содержат сайты связывания негативных регуляторов экспрессии генов — микроРНК. В англоязычной литературе такие circRNA часто называют microRNA sponges — «губки, впитывающие микроРНК». Связываясь с ними, микроРНК уже не могут взаимодействовать с комплементарными мРНК-мишенями и мешать их трансляции. Например, кольцевая РНК CDR1as содержит 74 сайта связывания с микроРНК miR-7, а мышиная кольцевая РНК, считанная с гена Sry (важен для определения пола), — 16 сайтов связывания с miR-138. Стоит, однако, отметить, что лишь для немногих кольцевых РНК показана способность связываться с микроРНК, то есть это скорее исключение, чем правило. Интересно, что circRNA найдены у некоторых одноклеточных эукариот, у которых вообще нет микроРНК, а именно — у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и малярийного плазмодия Plasmodium falciparum. Таким образом, связывание с микроРНК не может быть основной функцией кольцевых РНК, хотя во многих статьях его так позиционируют [4].

Ряд кольцевых РНК играет важную роль в противовирусном иммунитете. Например, у кур, устойчивых к вирусу птичьего лейкоза, 12 circRNA образуются в бόльших количествах, чем у обычных кур. Многие из этих молекул связываются с микроРНК, регулирующими экспрессию генов, которые связаны с такими иммунными процессами, как активация В-лимфоцитов и презентация антигена. Любопытно, что иммунная система тоже влияет на синтез кольцевых РНК. Например, иммунные факторы NF90 и NF110 (сплайс-варианты гена ILF3) стимулируют образование circRNA из созревающего транскрипта в ядре. В условиях же вирусной инфекции эти белки уходят в цитоплазму, где связываются с вирусными мРНК и тормозят жизненный цикл вируса; количество ядерной circRNA при этом снижается, что может модулировать экспрессию генов. Кольцевые РНК могут участвовать в подавлении инфекции и путем связывания вирусных или клеточных микроРНК, мешающих иммунному ответу [5].

Известно, что большинство событий бэксплайсинга затрагивает экзоны и происходит в РНК генов, кодирующих белки. В связи с этим возникает вопрос: а могут ли кольцевые РНК сами кодировать белки или хотя бы более короткие пептиды? Трансляция большинства мРНК начинается с распознавания рибосомой видоизмененного нуклеотида на 5′-конце мРНК, так называемого кэпа. У кольцевых РНК нет свободного 5′-конца, поэтому у них не может быть и кэпа. Однако некоторые клеточные и вирусные РНК могут транслироваться в отсутствие кэпа при участии особой последовательности — IRES (от англ. Internal Ribosome Entry Site, внутренний сайт посадки рибосомы) [8]. С кольцевыми РНК могло бы происходить то же самое.

И действительно, искусственные circRNA, содержащие IRES и кодирующие какой-нибудь пептид, удавалось транслировать. Однако показано, что большинство кольцевых РНК в живых клетках не связаны с рибосомами, поэтому вряд ли их трансляция носит массовый характер. Пока известны две кольцевые РНК, по которым, вероятно, синтезируются белки in vivo — это circMbl и circZNF609. Стоит отметить, что эти молекулы образуются несколько нестандартно: в первом случае бэксплайсинг затрагивает первый экзон, который, как мы помним, обычно в состав кольцевых РНК не включается, а во втором в circRNA попадает фрагмент 5′-нетранслируемой области исходного транскрипта, который обладает свойствами IRES. Возможно, синтез белков по circRNA возможен только в особых условиях, например, при стрессе — тепловом шоке или голодании [4].

Если предположить, что какая-то кольцевая РНК содержит открытую рамку считывания с числом нуклеотидов, кратным трем, то теоретически трансляция такой РНК может протекать по механизму катящегося кольца. Результатом такой трансляции была бы теоретически бесконечная цепочка повторяющихся блоков аминокислот, и рост ее ограничивался бы процессивностью рибосом. Подобные случаи пока не известны для клеточных кольцевых РНК, однако нечто похожее происходит с вироидной кольцевой РНК, ассоциированной с вирусом желтой пятнистости риса [4].

Методы обнаружения и базы данных кольцевых РНК

Последние успехи в обнаружении кольцевых РНК связаны с усовершенствованиями технологии секвенирования РНК, такими как увеличение длины одиночных прочтений, улучшение алгоритмов сопоставления РНК с известными генами и расширение библиотек РНК. Кольцевые РНК можно отличить от линейных с помощью биоинформатического подхода (по результатам секвенирования) или «мокрым» способом — с помощью экзонуклеаз. Как упоминалось выше, эти ферменты быстро расщепляют линейные РНК, но не трогают кольцевые. С помощью экзонуклеаз идентифицировали тысячи кольцевых РНК, но всё же большинство circRNA описали благодаря высокопроизводительному секвенированию с использованием специальных алгоритмов [9], [10].

В настоящее время функционирует несколько баз данных, посвященных кольцевым РНК, и онлайн-инструментов для работы с ними. В их числе:

• Circ2Traits— содержит информацию о кольцевых РНК, связанных с заболеваниями человека;
• CircInteractome — онлайн-инструмент для определения сайтов связывания с микроРНК и белками в кольцевых РНК;
• CircRNADb— содержит детальную информацию о хорошо изученных кольцевых РНК;
• HumanViCe — хранилище последовательностей кольцевых РНК, которые могут связываться с клеточными или вирусными микроРНК в зараженных клетках.

Медицинское значение кольцевых РНК

Кольцевые РНК в разном количестве выявляются в плазме крови, причем в периферической крови их даже больше, чем в клетках органов. Причины этого неясны, особенно если учесть тот факт, что в 25-процентной сыворотке circRNA распадаются всего через 30 секунд (в клетке средняя кольцевая РНК существует 1–2 дня). Как бы то ни было, наличие и количество некоторых кольцевых РНК в плазме крови может служить важным показателем здоровья организма. Иными словами, кольцевые РНК можно использовать в качестве биомаркеров для диагностики и определения стадии таких патологий, как коронарные заболевания сердца, различные виды рака (в том числе лейкемия), диабет и рассеянный склероз [4].

Некоторые кольцевые РНК связаны с клеточным старением. Так, circPVT1 действует как ингибитор старения пролиферирующих фибробластов [9]. Ряд кольцевых РНК ассоциирован с возрастными изменениями организма: например, идентифицированы молекулы, связанные со старением мышц у мартышек [11].

К настоящему моменту известны 10 кольцевых РНК, вовлеченных в развитие сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний (например, сахарного диабета). Уже упоминавшаяся circANRIL может защищать от атеросклероза, подавляя созревание рРНК и сдерживая этим деление клеток, избыточная пролиферация которых ведет к формированию атеросклеротических бляшек. Кольцевая РНК под названием MICRA может сигнализировать о нарушениях работы левого желудочка, возникших вследствие инфаркта миокарда. При гипертрофии сердца и сердечной недостаточности наблюдается снижение синтеза ряда кольцевых РНК [4].

Для некоторых клеточных РНК показана связь с сахарным диабетом. Известно, что гиперпродукция микроРНК miR-7 в β-клетках поджелудочной железы способствует развитию диабета, а гиперпродукция ciRS-7 — кольцевой РНК, связывающей miR-7, — в этих клетках, напротив, улучшает секрецию инсулина [9].

В нервных тканях различных организмов (от плодовой мушки до человека) находят особенно много кольцевых РНК. Возможно, это связано с большей распространенностью альтернативного сплайсинга в нейронах. Кроме того, кольцевые РНК в них могут выполнять особые функции, связанные с проведением нервных импульсов. Белок Qki, задействованный в образовании circRNA, участвует в развитии олигодендроцитов и регулирует миелинизацию, а также подавляет образование дендритов в центральной нервной системе. Мутации гена этого белка связывают с атаксией (расстройством координации движений) и шизофренией [4]. Есть свидетельства и о связи кольцевых РНК с болезнью Альцгеймера [9], [11].

Более 20 кольцевых РНК связаны с развитием разных видов рака, таких как колоректальный рак, рак яичника, мочевого пузыря, молочной железы, печени, желудка, почек и предстательной железы. Онкологические процессы часто сопровождаются транслокациями, которые приводят к появлению специфичных для определенных опухолей видов circRNA. Чаще всего кольцевые РНК, ассоциированные с развитием рака, функционируют как «губки» для микроРНК [4].

Поскольку кольцевые РНК, по всей вероятности, вовлечены в патогенез ряда заболеваний или способны модулировать их течение, их также рассматривают как потенциальные мишени терапии и терапевтические агенты.

Литература

1. Обо всех РНК на свете, больших и малых;
2. Биоинформатика в мире РНК-структур;
3. Белки против РНК — кто первым придумал сплайсинг?;
4. Lesca M. Holdt, Alexander Kohlmaier, Daniel Teupser. (2017). Molecular roles and function of circular RNAs in eukaryotic cells. Cell. Mol. Life Sci.;
5. Man Wang, Fei Yu, Wei Wu, Yuan Zhang, Wenguang Chang, et. al.. (2017). Circular RNAs: A novel type of non-coding RNA and their potential implications in antiviral immunity. Int. J. Biol. Sci.. 13, 1497-1506;
6. Эпигенетика псориаза: молекулярные отметины судьбы;
7. Нобелевская премия по медицине и физиологии 2016: за самоедство;
8. Бактерии тоже могут начинать синтез белка на IRES;
9. John Greene, Anne-Marie Baird, Lauren Brady, Marvin Lim, Steven G. Gray, et. al.. (2017). Circular RNAs: Biogenesis, Function and Role in Human Diseases. Front. Mol. Biosci.. 4;
10. 12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот;
11. Amaresh C. Panda, Ioannis Grammatikakis, Rachel Munk, Myriam Gorospe, Kotb Abdelmohsen. (2017). Emerging roles and context of circular RNAs. WIREs RNA. 8, e1386;
12. Linda Szabo, Julia Salzman. (2016). Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nat Rev Genet. 17, 679-692;
13. Alu: история одной последовательности.