Молекулярная биология

«Поднимите мне точность, не вижу» — новый протокол секвенирования для поиска драйверных мутаций

В течение нашей жизни наши клетки накапливают мутации. Это происходит под действием внутренних процессов, внешних мутагенов и из-за перенесенных болезней. При этом генетическая однородность ткани снижается, в ней появляется все больше скоплений клеток с одинаковым профилем мутаций. Эти островки-колонии еще называют клонами, это потомки одной клетки. Казалось бы, безобидно. Однако давайте рассмотрим набор изменений генома какой-нибудь из таких клеток. Среди безобидных опечаток в ДНК встречаются так называемые драйверные мутации. Эти ошибки по одиночке редко опасны, однако если клетка соберет определенное «комбо» из них, она окажется на скользкой дорожке злокачественной трансформации.

Традиционные методы, такие как микроскопия и анализ клеточных культур in vitro низкоэффективны, то есть не позволяют быстро анализировать большой объем биоматериала. Гораздо заманчивее использовать полногеномное секвенирование. Оно позволяет эффективно определить, сколько деталей «временной бомбы» клон собрал, то есть сколько драйверных мутаций накопили его клетки. Но скорость — не главное. Необходимо быть уверенными, что изменение ДНК, которое мы видим после секвенирования — мутация, а не ошибка нашего метода. Следовательно, частота ошибок секвенирования должна быть меньше частоты возникновения мутаций в геноме.

Lawson et al. предлагают в качестве такого инструмента метод полногеномный NanoSeq. Он разработан на основе дуплексного секвенирования, при котором идет чтение как кодирующей, так и комплементарной цепи. После некоторых модификаций ученым удалось добиться точности, в 100 раз превышающей частоту возникновения мутаций. Этот метод, модифицированный для секвенирования полного генома, отвечает всем критериям для поиска драйверных мутаций. — Somatic mutation and selection at population scale, «Биомолекула»: «12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот», «Генетический профиль с рождения: эффективность применения полногеномного секвенирования в клинической практике».

Лиганд сделал свое дело, лиганд должен уйти

Для запуска рецепторного каскада нужно, чтобы рецептор связался с лигандом. Часто для нормального сигналинга нужно, чтобы лиганд сначала прочно и избирательно (с высокой аффинностью) связался с рецептором, а затем быстро диссоциировал. На словах просто и очевидно. Но как в процессе эволюции возникают такие рецепторы, которые до связывания с лигандом имеют большое сродство к нему, а после — низкое?

Оказывается, что при связывании молекулы-активатора с рецептором происходит изменение его конформации из-за которого энергия комплекса возрастает. Двум молекулам в таком случае выгоднее «разбежаться» (сумма их энергий ниже) и лиганд покидает сайт связывания рецептора. Этот феномен называется облегченная диффузия.

В своей статье Broerman et al. описывают, как смогли использовать эту теорию для дизайна белков с «конформационным переключателем». С помощью него ученые смогли изменить время, которое аналог интерлейкина 2 (Neo2) удерживается на рецепторе интерлейкинов. Обычно диссоциация занимает часы, однако Neo2, к которому добавили конформационный переключатель, проводил в комплексе с рецептором в 5700 раз меньше времени. Такое рекордное изменение кинетики диссоциации позволит легче контролировать запуск сигнального каскада интерлейкина 2 и многих других медленно диссоциирующих лигандов. — Design of facilitated dissociation enables timing of cytokine signalling, «Биомолекула»: «Конструкторское бюро белков».

Синтетическая биология

Генетическая модификация микробиома прямо в кишечнике

Учитывая то, насколько сильно на физиологию влияет микробиом, идея им манипулировать в терапевтических целях уже давно поселилась в умах ученых и разработчиков лекарственных препаратов. А как насчет генной инженерии микрофлоры кишечника... прямо в кишечнике?

Gelsinger et al. разработали систему MetaEdit, которая проводит вставку генетических конструкций в геном конкретных видов-резидентов микрофлоры кишечника in vivo. Система MetaEdit создана на основе CRISPR-ассоциированных транспозаз (CAST), которые осуществляют вставку в определенный локус нужной исследователю конструкции. Плазмиду с CAST «загружают» в особый штамм кишечной палочки, которая при попадании в ЖКТ «передает» CAST резидентным бактериям с помощью конъюгации.

Ученым удалось генетически модифицировать таким образом бактерию Bacteroides thetaiotaomicron (Bt) микробиома мыши. Клетки Bt получили фермент метаболизма инулина. Таким образом, изменяя содержание инулина в рационе грызуна, долю Bt в микрофлоре можно было регулировать.

Еще более интересный опыт исследователи провели с сегментированными филаментными (нитчатыми) бактериями (СФБ). Эти бактерии играют большую роль в работе иммунной системе. Они способствуют развитию лимфоидной ткани кишечника, созреванию В- и Т-лимфоцитов и активируют ответ врожденного иммунитета при инфекции. Gelsinger et al. смогли заставить СФБ экспрессировать флуоресцентный белок для лучшей их визуализации. На горизонте — оптимизация микрофлоры для модуляции иммунитета, однако пока опыты проводят только на мышах. — Metagenomic editing of commensal bacteria in vivo using CRISPR-associated transposases, «Биомолекула»: «Им­му­но­сти­му­ли­ру­ю­щие филаментные бактерии: наконец-то они приручены!».

Физиология

О том, как знание (о PIEZO-рецепторах) рождалось в муках

О запуске сокращений матки при родах сигнальными веществами известно довольно много, однако об участии в этом процессе ионных каналов-механорецепторов известно довольно немного. PIEZO-рецепторы — это ионные каналы, которые открываются в ответ на растяжение клеточной мембраны. При этом в клетку входят ионы кальция — вторичные мессенджеры, регулирующие огромное количество процессов в клетке от мышечного сокращения до экспрессии генов. Хорошо известно о роли PIEZO в механорецепции. Они позволяют нам чувствовать прикосновения. Кроме того, эти каналы обеспечивают нормальный тонус наших сосудов. PIEZO-рецепторы гладкой мышцы капилляров реагируют на изменения кровяного давления.

Первое общение с ребенком, которое происходит еще до его рождения, возможно именно благодаря механорецепторам. Однако, как выяснили Zhang et al., они необходимы не только для того, чтобы мать могла почувствовать движения ребенка в утробе.

Оказалось, что нокаут каналов PIEZO1 и PIEZO2 у мышей вызвал осложнения при родах. Роды у самок с таким фенотипом длились больше суток, тогда как в контрольной группе этот процесс завершался за два часа. Ученые выяснили, что для нормальных родов достаточно работы хотя бы одного из двух каналов в матке или иннервирующих ее нейронах дорсального ганглия.

Zhang et al. пришли к выводу, что механическая стимуляция матки до родов вызывает постоянный вход кальция через каналы PIEZO. Благодаря этому, в частности, повышается экспрессия необходимых для родов генов. — PIEZO channels link mechanical forces to uterine contractions in parturition, «Биомолекула»: «Магнитоуправляемая перестройка цитоскелета: история о том, как ученые крутили клетки на магнитах».

Астроциты улавливают активность синапсов с помощью тонкой «обертки»

Представьте себе офис большой компании. Сотни сотрудников трудятся за своими рабочими местами, шлют друг другу электронные письма и обмениваются новостями в буфете. Это — нейроны. Как и аналитики, бухгалтеры и менеджеры в компании, они не «висят в вакууме». Им нужно рабочее место, переговорная, кофемашина и другие удобства. Не говоря уже об услугах клининга и банально стенах офиса. Оптимальную среду для работы нейронов создает глия. Это само здание офиса и работники кафетерия с охранниками в одном лице. Более того, в последние годы обнаруживается все больше свидетельств тому, что глия (а именно астроглия) участвуют и в обработке информации совместно с нейронами.

Benoit et al. в своей статье в журнале Cell описали, как астроциты формируют тонкую «обертку» из отростков вокруг скоплений синапсов. Ранее уже было известно, что астроциты, хотя и не могут сами генерировать потенциалы действия, имеют рецепторы нейромедиаторов. Когда нейромедиатор, выделившийся из синапса, попадает на рецептор астроцита, он отвечает генерацией кальциевой волны. Это изменение внутренней концентрации кальция может распространяться по сети астроцитов, так как их цитоплазма соединена щелевыми контактами.

Benoit et al. обнаружили структуру, где кальциевые волны зарождаются. Синапсы внутри астроцитарной «обертки» выделяют при активации нейромедиатор. Он «ловится» рецепторами астроцитов, формируя кальциевую волну. Эта волна, распространяясь по сети астроглии, сливается с волнами от других «оберток». Таким образом, астроциты обрабатывают сигналы от разных кластеров синапсов. — Astrocytes functionally integrate multiple synapses via specialized leaflet domains, «Биомолекула»: «Паразит-виртуоз: раковая опухоль способна расти за счет активности мозга», «Почему помощники нейронов „ползают“ и „прыгают“?».