Конкурс «био/мол/текст»-2018

Эта работа опубликована в номинации «Биофармацевтика» конкурса «био/мол/текст»-2018.

---

Партнер номинации — медицинская компания «Инвитро».

---

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.

---

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Целебные травы или синтетические таблетки?

Бывает так: вы проснулись утром и чувствуете — голова раскалывается, глаза слезятся, горло болит так, что не можете даже выпить любимый кофе, а встать с постели мешает общая слабость. И если в детстве вы могли остаться дома и пропустить скучные уроки, то сейчас на работе аврал и болеть просто некогда. Что же делать? Среди ваших знакомых обязательно есть хотя бы один человек, который посоветует лечиться травами, а не «химией». По его мнению, растения способны вылечить не только обычную простуду, а вообще все заболевания. Да и в аптеке многие просят натуральные препараты, а у синтетических — недоверчиво изучают инструкцию. Что ж, возможно в этом есть рациональное зерно, хотя с использованием фитопрепаратов и связано много мифов [1].

Растения применяются в медицине с самых давних времен, ведь у древних не было других способов борьбы с болезнями. Еще в начале XX века растения составляли около 80% всех используемых лекарственных средств (ЛС). Позже, благодаря успехам химии, синтетические, гормональные препараты и антибиотики значительно потеснили фитопрепараты. Однако во всем важен баланс, и, к счастью, люди поняли это вовремя. В последнее время вновь возрастает популярность растительных препаратов [2], [3]. Почему?

Лекарственные растения (ЛР) содержат биологически активные вещества (БАВ), которые влияют на биологические процессы в организме человека и животных [4]. Структура многих БАВ настолько сложна, что растения еще долго будут являться их единственным источником. Известно около 20 000 веществ, которые получаются только из растений [5]. Изготовленные на их основе фитопрепараты оказывают длительное мягкое фармацевтическое действие, малотоксичны и реже вызывают аллергические реакции, их можно длительно применять без существенных побочных явлений (что важно при коррекции хронических заболеваний, а также пожилым людям и детям) [2].

В клетках синтез органических веществ протекает, как правило, в мягких условиях (небольшая температура, нормальное давление, малый расход энергии) под действием различных ферментов. А химику, чтобы синтезировать многие БАВ, нужны дорогостоящие исходные вещества, экстремальные температура и давление, и при этом синтез займет много времени, а в итоге — полученный препарат будет стоить достаточно дорого. А благодаря тому, что растение содержит много различных БАВ, с его помощью можно одновременно лечить основное и сопутствующие заболевания [2], [6]. Часто одни препараты растений способны усиливать действия других (синергизм) [7–9]. Также фитопрепараты обладают хорошей совместимостью с синтетическими препаратами, позволяя, при их разумном сочетании, существенно повышать терапевтический эффект лечения. Бонусом фитопрепаратов является способ их применения — часто перорально или наружно, что весьма удобно [2].

Конечно, ЛР не панацея. И «натуральность» фитопрепаратов вовсе не гарантия абсолютной безвредности для организма человека. Многие растения содержат ядовитые вещества (алкалоиды, сердечные гликозиды и др.) и при неправильной дозировке могут вызвать отравление. Химический состав растений непостоянен и значительно изменяется в зависимости от условий произрастания и времени сбора, а также зависит от технологии получения лекарственных препаратов (ЛП). А растущие вдоль дорог или у заводов растения могут содержать тяжелые металлы, канцерогены и прочие токсиканты. Вряд ли вы хотите, чтобы все это попало в ваш организм вместе с целебным чаем или отваром. Чтобы этого не произошло, прежде чем фитопрепарат поступит в аптеку, ученые тщательно изучают химический состав лекарственных растений, анализируют, какие БАВ входят в их состав и как они влияют на организм человека, а также разрабатывают правила стандартизации и проверки качества этих растений. Для этого используют разнообразные методы: спектрофотометрические, фотоэлектроколориметрические, титриметрические, полярографические, хроматографические, гравиметрические и др. (рис. 1).

А если количество действующих веществ в исследуемом лекарственном растительном сырье (ЛРС) или ЛС не могут быть точно определено химическими и физико-химическими методами, в дело вступают фармакологи и применяют биологическую стандартизацию. Например, сила действия препарата, содержащего сердечные гликозиды, определяется на животных (кошках, голубях, лягушках) и выражается в единицах действия в 1 г сырья. В результате испытаний устанавливают наименьшие дозы, которые вызывают систолическую остановку сердца. Итак, современные фармацевты, химики, биологи, фармакологи словно объединяют усилия с травниками и шаманами древности, чтобы окончательно победить все болезни.

Возможно, вы думаете, что фитопрепараты — это только отвары и настойки, сборы и порошкообразное сырье в коробках? Ежегодно в России заготавливаются десятки тысяч тонн ЛРС. Для медицинских целей, согласно нормативной документации, используется около 260 видов ЛРС. Около 90 видов разрешено для реализации в аптеках, а 2/3 собранного сырья поступает на предприятия химико-фармацевтической промышленности для производства лекарственных средств [10], [11]. Да-да, многие знакомые вам лекарства изготовлены на основе растительного сырья. Загляните в домашнюю аптечку, посмотрим, сколько вы найдете там препаратов из следующего списка.

• Нервная работа? Помогут растительные препараты «Новопассит», «Валокордин», «Валокормид», «Валоседан», «Корвалол», «Дормиплант».
• Болит горло? Пригодятся ЛС шалфея лекарственного («Доктор Тайсс», «Сальвин»), комплексный препарат «Ротокан» или иммуностимулирующие леденцы «Тайсс» (на основе экстракта эхинацеи).
• Кашель? Поможет «Пертуссин» (чабрец).
• Проблемы с сердцем? Вот вам кардиотонические ЛС на основе сырья боярышника («Кардиовален», «Кардиплант», «Крабезид») и ландыша («Коргликон», «Конвафлавин» и «Капли Зеленина»).
• При лечении урологических заболеваний пригодится комплексный растительный препарат «Марелин».
• При холецистите — «Танацехол» (пижма).
• При нарушениях венозного кровообращения помогут ЛС на основе семян и листьев конского каштана: «Веноплант», «Эскузан», «Эсфлазид».
• Экстракт корней диоскореи («Полиспонин») эффективен при лечении атеросклероза головного мозга и сосудов сердца. А также сапонины диоскореи — исходные вещества для получения кортикостероидных гормональных ЛС.
• Для лечения витилиго (нарушения пигментации кожи) используют ЛС, содержащие растительные фурокумарины («Псорален», «Аммифурин», «Анмарин», «Бероксан»).
• При запорах помогут ЛС, обладающие слабительным действием: «Кафиол», «Агиолакс» (листья и плоды кассии остролистной), «Рамнил» (кора крушины).
• Самой большой и широко используемой в фармации группой растительных БАВ являются алкалоиды. ЛС на их основе применяют как средства:
  • гипотензивные («Резерпин», «Раунатин» из раувольфии змеиной, «Винкамин» из барвинка малого);
  • возбуждающие ЦНС («Стрихнина нитрат» — из чилибухи);
  • отхаркивающие («Глаувент» из термопсиса);
  • антиастматические («Астматин» из белены);
  • желчегонные («Берберина бисульфат» из барбариса);
  • противоопухолевые («Винбластин», «Винкристин», «Розевин» из катарантуса розового, колхаминовая мазь из безвременника великолепного).

И это еще далеко не полный список ЛС на основе растений, которые вы можете купить в аптеке.

Возможно, вы все равно считаете, что фитопрепараты — это прошлый век, и современная фармация уходит исключительно в сторону химического синтеза? Тогда что вы скажите на следующие цифры — в настоящее время каждый третий ЛП на мировом рынке — растительного происхождения. А в некоторых фармакотерапевтических группах ЛС (например, применяемых при лечении сердечнососудистых заболеваний) они составляют около 80% [12]! В России препараты растительного происхождения занимают около 40% от общего количества используемых в практической медицине лекарственных средств [13]. В странах Евросоюза этот показатель меньше: на растительные лекарства приходится до 10% общего объема рынка ЛС. Зато в Японии и странах Юго-Восточной Азии — до 40%. А в некоторых странах (Индия, Китай, Пакистан, Шри-Ланка, Мали, Танзания) фитопрепараты являются более распространенными, чем лекарства синтетического происхождения [12].

Как объяснить повышение интереса к фитопрепаратам в последнее десятилетие?

Сыграло свою роль появление, в связи с не всегда обоснованным назначением синтетических лекарств, новой нозологической формы заболевания — «лекарственной болезни». Сейчас, по данным ВОЗ, 2,5–5% госпитализированных составляют пациенты с осложнениями, вызванными применением ЛП [12]. При приеме фитопрепаратов случаи непереносимости и проявления лекарственной болезни наблюдаются сравнительно редко. А побочные эффекты от применения лекарств на основе растений встречаются в пять раз реже, чем при использовании других лекарственных средств [2]. Важным аспектом возрождения интереса к лекарствам из растений является применение современных методов изучения химического состава лекарственных растений и фитопрепаратов (тонкослойной и газожидкостной хроматографии, спектроскопии ядерного магнитного резонанса и др.) и совершенствования их стандартизации [2]. А также, специалисты компании Global Industry Analysis объясняют интерес к фитопрепаратам доступной ценой и верой людей (особенно пожилого возраста) в безопасность и эффективность растительных лекарств [14].

Лекарства на основе растений применяют в основном для лечения хронических, вялотекущих заболеваний почти всех органов или систем организма человека. Особенно широко фитопрепараты используют для лечения ЖКТ (4,9%), заболеваний нервной (4,8%), дыхательной (3,6%) и сердечно-сосудистой (2,4%) систем. Около 2,4% растительных препаратов относятся к группе жизненноважных и используемых для лечения онкологических заболеваний [14].

Заголовок этой главы не совсем разумный, ведь не стоит противопоставлять препараты, созданные на основе химического синтеза, средствам растительного происхождения. Для медицинской практики одинаково важны и те, и другие, не забывайте об этом и будьте здоровы!

Но вот проблема — естественные ресурсы ЛР ограничены, собирать растительное сырье желательно только в экологически чистых местах, да и почва со временем истощается. При этом многие растения растут только в определенных климатических условиях, какие-то являются редкими и исчезающими. В связи с этим идет активный поиск альтернативных источников получения БАВ растительного происхождения [15].

Из нескольких клеток получим растение

Одним из таких источников являются культуры клеток растений. Что это такое? Если очень упрощенно — представьте, что вы взяли несколько растительных клеток и поместили на питательную среду, по аналогии с тем как микробиологи выращивают бактерии. Как будет выглядеть полученное нами «растение в пробирке»? Отличается ли его внешний вид от обычного (интактного) растения? Чаще всего — да. Сравните следующие две фотографии. На обеих — табак обыкновенный (Nicotiana tabacum): интактное растение (рис. 2а) и каллусная культура (рис. 2б).

Каллус (от лат. callus — «толстая кожа, мозоль») — ткань, возникающая путем неорганизованной пролиферации (размножения клеток делением) дедифференцированных (потерявших специализацию) клеток органов растений.

В природе каллусная ткань образуется при травмах растений. Она защищает место ранения, может накапливать питательные вещества для регенерации. Функционирует непродолжительное время. Также каллус может образовываться in vitro («в пробирке»). При этом сначала каллусная ткань представляет собой нечто аморфное белого или желтоватого цвета. При правильном подборе компонентов питательной среды можно добиться регенерации целого растения из каллуса.

Но есть ли смысл тратить ресурсы на получение культуры растительных клеток? Оказывается, преимущества их использования для получения БАВ широко признаны [15]. Например, это независимость от влияния климатических, сезонных и географических условий; стабильность выпуска продукции в течение года; устранение проблемы истощения почв; получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестицидов и тяжелых металлов; возможность промышленного производства экзотических и малодоступных растений; часто более высокий выход вторичных метаболитов [5], [6], [16].

Если приведенные факты вас не убедили, то вот еще один. Промышленный способ выращивания изолированных культур дает возможность за короткий срок (часто 1–2 месяца) получать значительный объем ценного лекарственного сырья. Можно привести пример такого известного растения, по преданиям способного продлить жизнь и молодость, как женьшень (Panax). Из его корня выделяют комплекс тритерпеновых сапонинов (панаксозиды), которые обладают адаптогенным (повышают неспецифическую сопротивляемость организма к вредным воздействиям) и общетонизирующим действием [17]. Запасы дикорастущего женьшеня малы, для него характерны очень медленные рост и развитие. Годовой прирост корня дикорастущего растения составляет в среднем 1 г. В условиях выращивания женьшеня на плантациях сбор рекомендуется производить только на шестом году его произрастания (к этому времени накапливается достаточно БАВ), при этом «корень жизни» сильно истощает почву, и повторно в нее можно высаживать не ранее чем через 10 лет. А в культуре клеток растительной ткани панаксозиды можно извлекать в достаточном количестве уже на 15–25-й день роста. В качестве дополнительного бонуса — по токсичности препараты, получаемые из каллусного сырья, менее опасны [5], [17]. А ведь можно пойти еще дальше, внести в растительные клетки ген, отвечающий за синтез ценного в фармации белка. Таким образом получают растения-биофабрики, способные производить, например, съедобные вакцины. Подробно о трансгенных растениях рассказывается в статьях на «Биомолекуле» [18–20].

Вы убедились, что получение лекарств с помощью культуры клеток растений — это выгодно и перспективно? Тогда переходим от теории к практике.

Пособие юного биотехнолога

Итак, вы хотите получить культуру растительных клеток. Для начала нужен эксплант — группа клеток, отделенная от материнского организма (целого растения). Это могут быть клетки корня, листа, пыльцы и др. Для обеспечения максимальной генетической стабильности клонируемого материала в качестве исходного экспланта часто используют молодые слабодифференцированные ткани (кончики молодых стеблей и корней, пазушные почки, зародыши, части молодых проростков).

Когда собирают растительное сырье с целью получения определенной группы БАВ, то используют не всё растение, а ту его часть, в которой содержание этих веществ максимальное (кора дуба, цветки василька, листья алоэ, корни одуванчика). Логично было бы предположить, что клетки именно этого органа целесообразно использовать в качестве экспланта — но не всегда. Бывает, что высокая концентрация вещества отражает его накопление в ткани путем направленного транспорта, а синтезируется оно в другом месте.

Итак, у вас есть вырезанные маленькие кусочки растительной ткани (2–4 мм). Их тщательно промывают дистиллированной водой, стерилизуют и помещают на синтетическую питательную среду. Сосуды закрывают ватно-марлевыми тампонами и переносят в темное помещение, где строго поддерживают определенный режим. Для большинства культур нужна температура +24–26 °C, влажность 65–70%. Все манипуляции с растительным материалом проводят в ламинарном шкафу, который обеспечивает подачу стерильного воздуха в операционную зону (рис. 3). Через 2–3 недели образуется первичный каллус.

Проверим вашу интуицию: что произойдет с культурой клеток через некоторое время? Ведь она развивается в ограниченном пространстве на питательной среде и лишена доступа к земле. Правильно — из-за нехватки питательных веществ клетки начнут стареть и отмирать. Чтобы этого избежать, надо проводить пассирование, то есть через 4–6 недель пересеивать клетки на свежую питательную среду. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет. Необходимость пассирования для культур клеток показали американец Ф. Уайт и француз Р. Готре в 1930-х годах. Уайт занимался выращиванием изолированных корней томатов и показал, что корневая меристема может расти неограниченно долго во времени, если ее периодически пересаживать на свежую питательную среду. Культура некоторых его клонов поддерживалась около 30 лет [21].

Что же должно входить в питательную среду? Обычно макро- и микроэлементы, витамины, источники углерода, регуляторы роста растений. Внимательные читатели, возможно, спросят — зачем добавлять источники углерода, ведь мы со школы знаем, что растения способны к фотосинтезу? Дело в том, что в культуре клеток даже зеленеющие ткани не аутотрофны, то есть не способны к синтезу органических веществ из неорганических. Все компоненты питательной среды надо подбирать очень внимательно — ведь концентрации различных компонентов могут влиять на выход продукта.

Первые попытки культивировать изолированные клетки и ткани растений, предпринятые в конце XIX в. немецкими учеными (Г. Хаберландтом, Х. Фехтингом, С. Рехингером), оказались не совсем удачными, и проблема была в выборе питательной среды. Первопроходцы пытались выращивать кусочки тканей растений, используя растительные соки и экстракты, то есть питательные среды природного происхождения. Но транспорт и метаболизм питательных веществ у целого растения и изолированных клеток существенно отличается [22].

Далее начался поиск адекватных питательных смесей и условий, необходимых для культивирования растительных клеток. Только в начале XX века ученые стали использовать синтетические сбалансированные среды. Основа — среды, используемые для выращивания целых растений.

Впервые культуру тканей лекарственного растения — барвинка розового (Vinca rosea) — получил Ф. Уайт в 1945 г. В 1947 г. в лаборатории Р. Готре была получена культура ткани белены черной (Hyoscyamus níger).

Культуру клеток можно получить как на поверхности твердой питательной среды (твердофазная ферментация), так и в виде суспензии в жидкой питательной среде (глубинное суспензионное культивирование) (рис. 4).

Важным вопросом было, способны ли клеточные культуры, так непохожие на обычное растение, к синтезу нужных нам вторичных метаболитов? Оказалось — да. И доказано это было еще в 1947 году, когда Уайт и Готре экспериментально показали способность культуры ткани белены черной к синтезу алкалоидов, которые накапливались в каллусной массе и среде культивирования [13]. А позже выяснилось, что некоторые клеточные культуры синтезируют вещества, не обнаруженные у интактного растения. Так, кора вечнозеленого хинного дерева (Cínchona) содержит алкалоиды, обладающие антипротозойным действием, то есть подавляющие жизнедеятельность простейших (эффективны для профилактики малярии). Однако в культуре клеток этого растения накапливаются не алкалоиды, а антрахиноны. Коробочки мака снотворного (Papaver somniferum) используют как источники получения наркотика и анальгетика морфина, но в культуре клеток этого растения под влиянием элиситоров (низкомолекулярных веществ патогенов) образуется сангвинарин — алкалоид, усиливающий перистальтику кишечника и повышающий секрецию слюны.

Интересно, что каллус состоит из дедифференцированных клеток, «потерявших профессию». Клетки разных тканей и органов различаются по строению и выполняемым функциям — вполне конкретным для каждого типа клеток. А недифференцированные клетки — незрелые, не имеют определенной «профессии» в организме и способны многократно делиться. Подобрав необходимое соотношение регуляторов роста (фитогормонов) можно добиться дифференцировки каллусных клеток. Только стоит ли? Какие клетки нам надо получить в культуре, чтобы они синтезировали нужные нам вещества? Оказывается, для разных растений по-своему — например, в суспензионной культуре мака снотворного (Papaver somniferum) синтез алкалоидов начинается только после того, как в ней дифференцируется достаточно большое количество специализированных клеток млечников, предназначенных для депонирования метаболитов.

Дифференцированные корневые каллусы красавки обыкновенной (Atropa belladonna) синтезируют тропановые алкалоиды, недифференцированные — нет. Казалось бы, все ясно, но культуры клеток табака (Nicotiana) и моркови (Daucus) синтезируют большое количество никотина и антоциана при слабой дифференцировке клеток. А выход алкалоидов раувольфии (Rauwolfia) вообще наблюдается при использовании недифференцированных клеток. Всё сложно, и это еще не все параметры, влияющие на биосинтез веществ клеточной культурой.

Существует связь между скоростью роста культур и метаболизмом. Прямая связь — рост определяет степень агрегации клеток, оказывая косвенное влияние на синтез вторичных метаболитов. Достаточная степень агрегации может быть получена только в медленно растущих культурах. Существует и обратная связь — когда определяющим фактором является не агрегация, а кинетика скорости роста, когда первичные и вторичные пути метаболизма по-разному конкурируют за предшественник в быстро и медленно растущих клетках. Если условия среды благоприятны для быстрого роста, то в первую очередь синтезируются первичные метаболиты. Если быстрый рост блокирован, то начинается синтез вторичных метаболитов. Таким образом, низкая скорость роста клеток способствует высокому выходу метаболитов [22].

Аморфный каллус — скучно, а можно тополь в пробирке?

Что делать, если вам мало получить бесформенный каллус, и вы хотите вырастить «в пробирке» целый растительный организм? Кстати, зачем? Например, чтобы получить безвирусное растение. Это возможно, так как меристема (образовательная ткань, от греч. meristos — «делимый») обычно лишена вирусов. Поэтому с помощью микроклонального размножения из меристематических тканей можно получить безвирусные растения.

Впервые микроклональное размножение успешно применил француз Ж. Морель в 1960 г. для орхидеи. Из одного безвирусного экспланта в течение года он получил около 4 млн новых безвирусных растений [23]. Как вы уже поняли, преимуществом метода микроклонального размножения перед классическими методами является значительно более высокий коэффициент размножения (из одного экспланта можно получать от 10 000 до 1 000 000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны) (рис. 5) [23].

Как вызвать морфогенез (образование органов)? Во-первых, для индукции морфогенеза in vitro необходимо вызвать неоднородность в клеточных популяциях. Важнейшим условием морфогенеза является адгезия клеток (соединение клеток между собой), в результате которой образуются ткань и орган. Поэтому важна гравитация, способствующая клеточной дифференциации, что было доказано с помощью экспериментов с каллусной тканью пшеницы и кукурузы в космических условиях М. Карабаевым (1994 г.). Развитие клеток, дифференциация и регенерация растений подавляется космическими условиями. Причина — специфическое распределение клеток в клеточной популяции и слабость межклеточных контактов под действием невесомости [24]. А подробнее о поведении растений в космосе можно прочитать на «Биомолекуле» [25].

Какие именно органы будут образовываться из клеточной культуры? Это будет зависеть от соотношения фитогормонов — ауксинов и цитокинов. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки и последующей вторичной дифференцировки клеток и подготавливают их к делению, а цитокины инициируют клеточное деление. При изменении соотношения между этими фитогормонами и при добавлении других фитогормонов морфогенез может идти по-разному.

Как повысить выход целевого продукта?

Допустим, вы научились получать культуры клеток растений и добились синтеза этими клетками нужных БАВ (как добились — можно прочесть в [18]). Но что, если вам, словно старухе из сказки о золотой рыбке, этого мало? Вы хотите увеличить выход этих веществ. Как этого добиться?

Можно внести в питательную среду предшественник нужного нам продукта. Например, в корневищах тропической лианы диоскореи (Dioscorea) содержится диосцин. Это стероидный сапонин, который при гидролизе расщепляется на диосгенин и сахара. Диосгенин используют для производства гормональных препаратов кортизона и прогестерона [26]. Если вы внесете аминокислоту фенилаланин в среду для культивирования клеток, то добьетесь увеличения выхода диосгенина на 100%. Здорово, правда?

Также накопление вторичных метаболитов зависит от света, температуры, рН, а при суспензионном культивировании от аэрации, перемешивания, скорости вращения сосудов, газового состава и т.д. [27].

Не менее важно и правильно подобрать все компоненты питательной среды, а также их конкретное соотношение — ведь концентрации различных компонентов могут влиять на выход продукта. Например, в культуре клеток катарантуса розового (Catharanthus roseus) увеличение выхода алкалоидов, проявляющих противоопухолевое действие, связано с увеличением в среде концентрации сахарозы [28], [29].

А что делать, если рост биомассы в ферментере значительный, но нужных нам веществ образуется мало? Повысить выход целевого продукта можно с помощью иммобилизации. Что это такое, догадаться несложно: если «мобильность» — это способность быстро перемещаться, то «иммобилизация» — это создание неподвижности. Иммобилизованные клетки образуют биомассу гораздо медленнее, чем растущие в жидких суспензионных культурах, но они способны к интенсивной выработке метаболитов. Одно из условий при иммобилизации клеток — выделение метаболита в питательную среду, из которой его должно быть возможным легко извлечь (например, алкалоиды). Также для повышения выхода вторичных метаболитов можно использовать индуцированный мутагенез (обработку ионизирующим излучением или химическими мутагенами).

Кто рискнул первым?

В 1983 г. японская фирма Mitsui Petrochemical Industries опубликовала технологию получения шиконина с помощью культуры клеток воробейника краснокорневого (Lithospermum erythrorhizon), что стало началом эры биотехнологии, когда биотехнологическое использование культур клеток и тканей в качестве сырья в промышленных масштабах стало реальностью. Шиконин используется при кожных заболеваниях. Красные нафтохиноновые пигменты (производные шиконина) известны как антибактериальные и противоопухолевые вещества и используются при лечении рожистых воспалений, микробной экземы, трофических язв и ран. А в России широкое производство продуктов культуры растительных клеток началось с выпуска экстракта культивируемой биомассы женьшеня [17].

«Перчатка лисы», сердечная недостаточность и загадка Ван Гога

А сейчас давайте подробно рассмотрим пару примеров применения клеточных культур растений для синтеза таких необходимых нам лекарств. И начнем с получения карденолидов, гликозиды которых используют в медицине для лечения болезней сердца. Это особенно актуально, так как, по данным ВОЗ, сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире — ежегодно от них умирает больше людей, чем от какой-либо другой болезни [30].

Какая основная функция сердца? Вспоминая школьные уроки биологии, даже если на них вы играли в карты или смотрели в окно, скорее всего, скажете — «насосная». Сердце должно качать кровь. А если сердечная мышца по каким-то причинам ослабела — уменьшается сила сердечных сокращений, и вот уже сердце не в состоянии обеспечить необходимое кровоснабжение всех органов, и им не хватает кислорода. Пульс увеличивается, венозное давление повышается, появляются отеки... Но не будем о грустном. Лучше поговорим о том, как лечить такую сердечную недостаточность.

Наиболее эффективными средствами являются сердечные гликозиды (кардиогликозиды). Они вообще занимают особое место среди лекарств, применяемых при лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Почему? Сейчас разберемся.

Для начала, сердечные гликозиды до сих пор не имеют аналогов химического происхождения. Как и три века назад, в качестве источника этих веществ используют растительное сырье. Как же они действуют? Они усиливают и урежают сердечные сокращения, и сердце начинает перекачивать больше крови в единицу времени.

А если рассмотреть механизм кардиотонического действия сердечных гликозидов, мы увидим, что в его основе лежит влияние на калиево-натриевый насос кардиомиоцитов (мышечных клеток сердца), обмен ионов кальция, высвобождение катехоламинов (гормонов мозгового слоя надпочечников, например знакомого всем «гормона стресса» — адреналина) из лабильных депо, а также на уровень циклического аденозинмонофосфата (вторичного мессенджера, передающего внутрь клетки сигналы гормонов, которые не могут сами проходить через клеточную мембрану) и энергетическое обеспечение сокращения миокарда [31].

А вот вам еще один интересный факт о кардиогликозидах — это яды. Да, как говорил Парацельс, всё есть яд и всё есть лекарство: и то, и другое определяет доза. В больших дозах эти вещества нарушают проведение импульсов по проводящей системе сердца, повышают автоматизм сердца и приводят к его внеочередным сокращениям.

Познакомившись с фармакологическим действием, надо заглянуть внутрь и рассмотреть химическую структуру данных метаболитов. Все гликозиды — это молекулы, состоящие из двух частей: сахарной (гликон) и несахарной (агликон, генин). При гидролизе они способны распадаться на углеводный и неуглеводный компонент. А свое название получили от греческих слов glykys («сладкий») и eidos («вид»). Агликоны сердечных гликозидов имеют стероидную структуру, и именно они обеспечивают специфическое действие на миокард. А сахарный компонент определяет такие особенности гликозидов как растворимость, всасывание, проникновение через мембраны, связывание с белками, распределение, выведение, и, следовательно, влияет на активность и токсичность.

Общая формула агликонов кардиогликозидов представлена ниже (рис. 6). Присоединение сахарных остатков идет в положении С₃, где все агликоны содержат гидроксильную группу.

Как вам формулы? Впечатляют? Становится понятно, почему их сложно синтезировать химическим путем и стоит выделять из растительных источников.

А дальше речь пойдет об удивительных растениях, содержащих сердечные гликозиды. Высокие травы с фиолетовыми цветами, едким ароматом и горькими листьями — они являются одними из самых необычных украшений на клумбах. В Германии их называют шапочкой гномов или эльфов, в Англии — перчаткой лисы, во Франции — перчаткой Девы Марии, в Ирландии — ведьминым напёрстком. А чтобы предупредить о ядовитости растения, ему давали даже такие названия как кровавый палец и наперсток мертвеца. Ночью температура внутри цветков этих растений гораздо выше, чем температура окружающего воздуха, поэтому насекомые любят там пережидать холодные ночи. Во многих книгах и фильмах преступники используют в качестве яда именно эти растения.

Не догадались? Тогда вот вам еще она подсказка. Согласно немецкой легенде маленькая девочка получила в дар от рано умершей матери коробку с шитьем. Когда было особенно грустно, малышка надевала наперстки на пальцы и вспоминала мать. Злая мачеха, рассердившись, однажды ночью выкрала шкатулку и спрятала глубоко в садовой земле. А утром на том месте распустились чудесные цветы, похожие на наперстки. Однако, впитав в себя ненависть мачехи, они содержали страшный яд.

Это растения рода наперстянок (Digitalis). Корни латинского названия рода уходят к латинскому слову digitus — «палец» или «напёрсток», по форме венчика.

В последние годы жизни известный художник Винсент Ван Гог явно отдавал предпочтение желто-зеленому цвету в своих работах. Даже фоном к желтым цветам — выбрал желтый цвет (рис. 7а). Несколько портретов его лечащего врача написаны в этих же тонах, а в руках у доктора — веточка наперстянки (рис. 7б). Давайте поиграем в детективов — что не так на этой картине?

Правильно, окраска цветков наперстянки. А ведь у наперстянки, которую тогда использовали, цветы темно-красные. Научно доказано, что вещества, содержащиеся в наперстянке, способны искажать восприятие цвета. Предметы кажутся синими, желтыми или зелеными, все лица предстают смертельно бледными. Возможно, художник принимал препараты этого растения для лечения сердца и именно этим объясняется обилие желтого цвета в его картинах. С наперстянкой нужно быть осторожным, однако для лечения многих болезней сердца она необходима.

Существует много видов наперстянок. Но в медицине используют только несколько из них. Например, красавиц, которых вы видите на фото ниже (рис. 8, 9).

Наперстянка пурпурная (Digitalis purpurea) содержит сердечный гликозид дигитоксин, а из цветков наперстянки шерстистой (Digitalis lanata) извлекают дигоксин. Дигитоксин и дигоксин — это фитостероиды, сходные по структуре и эффектам. Сходные, но не одинаковые. С химической точки зрения дигоксин отличается от дигитоксина лишь дополнительной гидроксильной группой на двенадцатом атоме углерода. Различия в структуре обусловливают отличия в фармакологическом действии и свойствах. Дигоксин выводится из организма через почки, а дигитоксин — через печень, поэтому он может быть использован пациентами с неустойчивыми функциями почек. Тем не менее сейчас дигитоксин редко применяется в западной медицинской практике. А вот дигоксин является эталонным медикаментом группы сердечных гликозидов. По сравнению с дигитоксином он обладает меньшей липофильностью (большей полярностью), а также быстро всасывается и сохраняет активность при энтеральном введении. В меньшей степени, чем дигитоксин, он связывается с белками плазмы крови и быстрее выводится из организма. Использование дигоксина предпочтительнее из-за его меньшей токсичности, по сравнению с таковой у дигитоксина. Дигоксин включен в список основных лекарственных средств Всемирной организации здравоохранения — перечень наиболее важных ЛС, необходимых в базовой системе здравоохранения [32].

Что делать, если вы хотите получить много дигоксина, а наперстянки в большом количестве синтезируют дигитоксин? Нет ничего невозможного для хорошего биотехнолога! Ведь клеточную культуру можно использовать для биотрансформации. В клетках растений локализованы ферменты, способные менять функциональные группы добавленных извне химических соединений.

Недифференцированные культуры клеток наперстянки шерстистой сами не синтезируют сердечные гликозиды. Однако они могут осуществлять реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду. Биотрансформация дигитоксина в дигоксин идет за счет реакции 12-гидроксилирования.

Жонглируя генами, или Для биотехнолога возможно многое

Многие растения содержат вещества-предшественники для биосинтеза ценных биологических соединений (то есть при наличии нужных ферментов из этих предшественников могут образовываться ценные БАВ), однако они не имеют ферментов для полного синтеза этих соединений. Часто для целей метаболической инженерии достаточно переноса в клетку только одного гена. Давайте рассмотрим пример.

Наши клетки общаются. Сигналы (электрохимические импульсы) между нейронами (нервными клетками) передаются с помощью веществ — нейромедиаторов, которые выделяются в синапс (место контакта двух клеток). Примерно так же передается нервный импульс от нейронов к мышечной ткани или железистым клеткам. Одним из медиаторов является ацетилхолин [33]. Это основной нейромедиатор парасимпатической нервной системы. Окончания нервных волокон, для которых он служит медиатором, называются холинергическими, а рецепторы, взаимодействующие с ним, называют холинорецепторами.

В медицине широко используют вещества, которые являются конкурентными антагонистами ацетилхолина, то есть связываются с ацетилхолиновыми рецепторами, не вызывая их активации, но занимая место ацетилхолина. Это приводит к снижению тонуса органов (глаз, бронхов, сосудов и др.), уменьшению секреции желез (слюнных, потовых, желудочных). К таким веществам относятся тропановые алкалоиды, содержащиеся в растениях, прежде всего, скополамин, гиосциамин и атропин (рис. 10). Они используются в психиатрии, при спазмах гладкой мускулатуры, при брадикардии, при язвенной боли желудка и двенадцатиперстной кишки, в анестезиологической практике, в офтальмологии и психиатрии.

Посмотрите на химические структуры алкалоидов — они впечатляют и напоминают о школьных уроках химии со сложными формулами, которые, казалось, невозможно запомнить. Легко догадаться, что такие молекулы сложно, долго и дорого синтезировать химическим путем «в пробирке». А значит, проще найти растение, в котором уже налажен синтез нужных нам веществ, причем в мягких условиях под контролем ферментов.

Например, растение, название которого в переводе с итальянского языка означает «красивая женщина». Оно получило такое имя, потому что женщины Древнего Рима, а затем Италии и Испании широко использовали мидриатический эффект (вызывает расширение зрачка) основного алкалоида растения — атропина. На целебные и ядовитые свойства этого растения указывали Теофраст (около 372–287 гг. до н. э.) и Диоскорид (I в. н. э.), который называл его Strychnos manicos, что означает «сумасшедшее растение». В древнегерманских племенах были воины-берсерки, которые одевались в медвежьи шкуры и перед боем выпивали напиток с растением, произрастающим в буковых лесах Западной Европы. У воинов развивалось состояние сильного возбуждения, и они неистово шли на врага. В медицине восточных стран его применяли как наркотическое средство наряду с индийской коноплей, снотворным маком и болиголовом еще 2500 лет назад [23].

Это Atropa belladonna — красавка, или белладонна (рис. 11).

Латинское название происходит от греч. «atropos», «atropa» (в буквальном переводе — «неуступчивая, безвозвратная»). Так звали одну из трех мойр — древнегреческих богинь судьбы, — которая перерезала нить человеческой жизни, не считаясь с возрастом и полом. Возможно, так назвали растение из-за ядовитости. Однако в фармации широко используют листья и корни красавки в качестве источника алкалоидов. Основным алкалоидом красавки является гиосциамин. Это тропановый алкалоид, который при выделении из растения превращается в атропин — рацемат, состоящий из смеси лево- и правовращающих изомеров одного и того же вещества [34].

Благодаря фильмам вы знаете, как получить от врага ценную информацию. Достаточно одного укола специальным препаратом — и он расскажет всё. Мало кто знает, в ХХ веке в качестве «сыворотки правды» использовали скополамин. Это опасный наркотик, но, несмотря на это, применяется в медицине, например, для изготовления пластырей для лечения морской болезни, как седативное средство, для лечения паркинсонизма. Скополамин довольно распространенный алкалоид, но содержание его в растениях значительно меньше, чем гиосциамина. Например, из всех алкалоидов красавки гиосциамин составляет до 83–98%. Применение скополамина в медицине предпочтительней из-за меньшего количества побочных эффектов и более высокой биологической активности [35].

Но что делать, если мы хотим, чтобы красавка содержала исключительно нужный нам скополамин? Давайте посмотрим на формулы этих двух алкалоидов и найдем, чем они отличаются. Правильно, скополамин в левой части содержит дополнительное трехчленное кольцо, включающее кислород.

Реакции превращения одних веществ в другие в живых организмах катализируют (ускоряют) ферменты. Так давайте найдем фермент, катализирующий окислительные реакции преобразования гиосциамина в скополамин — что проще? Действительно, такой фермент был найден — это гиосциамин-6-β-гидроксилаза (рис. 12).

Только нашли этот фермент у другого растения — белены (в народе — куриной слепоты). Это ядовитое растение, которое покрыто мягкими железистыми волосками, издающими сильный дурманящий запах (рис. 13).

Фермент — это чаще всего белок. Структура всех белков организма закодирована в «молекуле жизни» — ДНК. Значит, можно с помощью специальных ферментов (рестриктаз) «разрезать» ДНК белены, выбрать кусочек ДНК (ген), кодирующий нужный нам фермент и ввести его в красавку. Подробно про способы введения «чужого» гена в растительные клетки можно почитать в [18–20], [36], [37]. Это и сделал в 1992 году японский ученый Д. Юн с коллегами. Он получил трансгенные растения, которые содержали в листьях и стеблях исключительно скополамин [34].

Что дальше?

Конечно, можно привести и другие примеры. Сегодня в разных странах для получения экономически важных веществ применяют культуры клеток более ста видов растений. Клеточные культуры используют для сохранения редких или находящихся под угрозой исчезновения видов растений, для скрининга клеток, а не растений, на наличие определенных признаков, например, устойчивости к гербицидам. Объединяя клетки разных растений, создают новые виды. Даже получают съедобные вакцины, о чем подробно рассказывается в [18]. Что же станет возможным далее? А это уже зависит от вас, дорогой читатель.

Литература

1. О подводных камнях траволечения;
2. Tatyana V Sambukova, Boris V Ovchinnikov, Vyacheslav P Ganapol’sky, Alexei N Yatmanov, Petr D Shabanov. (2017). Prospects for phytopreparations (botanicals) use in modern pharmacology. Rev Clin Pharm Drug Ther. 15, 56-63;
3. Носов А.М. (2018). Клеточные технологии: настоящее и перспективы. «Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Севере». 17–19;
4. О чем пахнут растения?;
5. Катлинский А.В. Курс лекций по биотехнологии. Москва, 2005. — 150 с.;
6. Буркова Е.А., Канарский А.В., Канарская З.А. (2014). Перспектива применения фитобиотехнологии для получения биологически активных веществ. «Вестник Казанского технологического университета». 14, 352–356;
7. Pittler M.H., Guo R., Emst E. Who monographs on selected medicinal plants (vol. 2). Geneva: WHO, 2004. — P. 142–145;
8. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: «Издательство Новая волна», 2012. — 420 с.;
9. Bruno David, Jean-Luc Wolfender, Daniel A. Dias. (2015). The pharmaceutical industry and natural products: historical status and new trends. Phytochem Rev. 14, 299-315;
10. Жохова Е.В., Гончаров М.Ю., Повыдыш М.Н., Деренчук С.В. Фармакогнозия: учебник для студентов фармацевтических колледжей и техникумов. М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2012. — 544 с.;
11. Ширкова И. (2013). Рынок фитопрепаратов — тенденции, проблемы, прогнозы. «Ремедиум». 4, 26–33;
12. N. G. Olenina, N. S. Mikheeva, N. M. Krutikova. (2018). SPECIFIC ASPECTS OF BENEFIT-RISK EVALUATION OF HERBAL MEDICINAL PRODUCTS: ANALYSIS OF REGISTRATION DOSSIERS. Vedomosti Nauchnogo tsentra ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya. 8, 84-91;
13. Григорян Э.Р. Методический подход к оптимизации ассортимента лекарственных растительных препаратов, используемых в условиях санаторно-курортного реабилитационного комплекса Кавказских Минеральных Вод: дис. ... канд. фарм. наук. — Пятигорск, 2015;
14. Бойко Н.Н., Бондарев А.В., Жилякова Е.Т., Писарев Д.И., Новиков О.О. (2017). Фитопрепараты, анализ фармацевтического рынка Российской Федерации. «Научный результат. Медицина и фармация». 4, 30–38;
15. Mulabagal V. and Tsay H.-S. (2004). Plant cell cultures — an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. Int. J. Appl. Sci. Eng. 2, 29–48;
16. Sonia Malik, Rosa M. Cusidó, Mohammad Hossein Mirjalili, Elisabeth Moyano, Javier Palazón, Mercedes Bonfill. (2011). Production of the anticancer drug taxol in Taxus baccata suspension cultures: A review. Process Biochemistry. 46, 23-34;
17. Смирнова Ю.Н., Решетняк О.В., Смоленская И.Н., Воевудская С.Ю., Носов А.М. (2010). Влияние регуляторов роста на синтез гинзенозидов в культуре клеток двух видов женьшеня. «Физиология растений». 3, 458–466;
18. Растения-биофабрики;
19. Игры в демиургов;
20. От ГМО к растениям будущего. Всё самое интересное о сложной работе современного селекционера;
21. Дитченко Т. И. Культура клеток, тканей и органов растений. Минск: БГУ, 2007. — 102 с.;
22. Вечканов Е.М. и Сорокина И.А. Основы клеточной инженерии. Ростов-на-Дону: ЮФУ, 2012. — 136 с.;
23. Куликов П.В. и Филиппов Е.Г. (1998). О методах размножения орхидных умеренной зоны в культуре in vitro. «Бюл. Главного ботан. сада». 125–131;
24. Зюбр Т.П., Пешкова В.А., Мурашкина И.А. Использование культуры клеток растении в биотехнологии лекарственных средств. Иркутск, 2008. — 65 с.;
25. Растения в космосе: инструкция по применению;
26. Кузьмина Н.А. Основы биотехнологии. Омск: ОмГПУ, 1995;
27. Васильева И.С. и Пасешниченко В.А. (2000). Стероидные гликозиды растений и культуры клеток диоскореи, их метаболизм и биологическая активность. «Успехи биологической химии». 40, 153–204;
28. Величко Н.А. Научные основы индуцированныго синтеза алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus L.: автореф. дис. ... док. тех. наук. — Красноярск, 2004. — 45 с.;
29. Arvind Verma, Into Laakso, Tuulikki Seppänen-Laakso, Aarre Huhtikangas, Marja-Liisa Riekkola. (2007). A Simplified Procedure for Indole Alkaloid Extraction from Catharanthus roseus Combined with a Semi-synthetic Production Process for Vinblastine. Molecules. 12, 1307-1315;
30. Сердечно-сосудистые заболевания. (2015). ВОЗ;
31. Sandeep Kumar Verma, Ashok Kumar Das, Gunce Sahin Cingoz, Ekrem Gurel. (2016). In vitro culture of Digitalis L. (Foxglove) and the production of cardenolides: An up-to-date review. Industrial Crops and Products. 94, 20-51;
32. Примерные перечни ВОЗ основных лекарственных средств. ВОЗ;
33. Молекула здравого ума;
34. Куцик Р.В., Зузук Б.М., Недоступ А.Т., Пецко Т. (2003). Беладонна обыкновенная. Atropa belladonna L. «Провизор». 22;
35. Alejandra B Cardillo, Julián Talou, Ana M Giulietti. (2008). Expression of Brugmansia candida Hyoscyamine 6beta-Hydroxylase gene in Saccharomyces cerevisiae and its potential use as biocatalyst. Microb Cell Fact. 7, 17;
36. Молекулярное клонирование, или как засунуть в клетку чужеродный генетический материал;
37. 12 методов в картинках: генная инженерия. Часть II: инструменты и техники.