В Академическом районе города Москвы, под всевидящим оком президиума РАН, разместилось немало научных институтов. Есть среди них настоящие архитектурные шедевры — представители советского монуметализма, но встречаются и более скромные экземпляры. Так, где-то во дворах, у ТЭЦ, за главным зданием Сбербанка России, затерялось малоприметное здание, полосато раскрашенное в серо-белые тона, словно штрих-код. Мало кто знает, что за его стенами каждый день снуют ученые в белых халатах, и в жарких спорах рождаются новые научные идеи. Называется это учреждение Институтом биоинженерии. Под его кровом находится около десятка лабораторий, занимающихся широким кругом исследовательских задач; есть среди них и небольшой научный коллектив, для которых «хитин» и «хитозан» — не просто слова, а источник вдохновения. О нешуточных «хитиновых страстях» и жизни лаборатории изнутри расскажу вам я, кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории инженерии биополимеров, Анастасия Зубарева.

Почему хитин и хитозан?

«Чем же обусловлен такой небывалый интерес к этим полисахаридам?» — спросите меня вы. Ведь существуют и другие полимеры. Взять хотя бы самое распространенное на нашей планете органическое вещество — целлюлозу. Почему не изучать ее? Действительно, у хитина и целлюлозы много общего — они являются ближайшими структурными родственниками (их отличает лишь один заместитель в полимерной цепи; рис. 1) и выполняют схожие функции. Так, целлюлоза — основной «опорный» материал клеточной стенки растений, в то время как хитин отвечает за «надежность» брони членистоногих и грибов.

Но есть два ключевых отличия хитина, делающих его фаворитом ученых. Во-первых, он является более реакционноспособным, что значительно расширяет область практического применения; во-вторых, хитин способен деградировать под действием ферментов организма. Целлюлоза является более инертной в этом отношении, поскольку у млекопитающих отсутствует переваривающий ее фермент. Исключение составляют лишь травоядные животные, призывающие на помощь бактерий-симбионтов.

При нагревании и обработке концентрированной щелочью хитин превращается в хитозан. Такая модификация хитина, пожалуй, является самой перспективной, поскольку взамен ацетильной образуется аминогруппа. Ну а такая группа — настоящая мечта химика! Она не только придает полимеру растворимость в растворах разбавленных кислот, но и делает возможными различные химические превращения. Учитывая факт «разрезания» полимерной цепи с помощью ферментов или кислот, хитозан превращается в настоящий конструктор «Лего», где каждый сможет смастерить полимер «на свой вкус и цвет». Благодаря этому факту, хитозан нашел свою нишу в самых различных областях: он всегда придет на помощь экологу, биотехнологу, фармацевту или агроному. Кто знает? Может, через десятки лет он пригодится и космонавту, испытывающему на орбитальной станции антигравитационные свойства хитина.

От атомных подводных лодок до нанобиотехнологии: основные вехи истории лаборатории инженерии биополимеров

Именно эти практически безграничные горизонты в исследовании хитина и хитозана привели 25 лет назад к открытию лаборатории инженерии ферментов, занимающейся их изучением (рис. 2). Первые шаги в этом направлении сотрудники делали на базе alma mater — Института элементорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, — где им приходилось решать непростую задачу: разрабатывать оригинальное решение для ликвидации последствий крушения атомной подводной лодки «Комсомолец» в 1989 году. В данной ситуации как никогда кстати пришлись сорбционные свойства хитозана в отношении радионуклидов, основанные на «захвате» опасных атомов азотом в составе аминогрупы хитозана (хотя существуют и другие сценарии данного процесса, активно обсуждаемые радиохимиками). Ученые предложили создать хитиновый щит на пути радиации, заполнив сшитым полимером отсеки лодки.

В дальнейшем научный коллектив, возглавляемый Валерием Петровичем Варламовым, встал у истоков Центра «Биоинженерия» РАН. В результате в 1989 году вместе с рождением нового института РАН образовалась и новая лаборатория, носящая название инженерии ферментов. «Причем тут ферменты?» — спросите меня вы. Дело в том, что главным направлением работы Центра была (и остается) генетическая инженерия растений. Получение новых сортов, несущих ген хитиназы и, следовательно, устойчивых к действию вредителей, является популярным направлением и на сегодняшний день. Следовательно, основными задачами лаборатории стали выделение и очистка ферментов, разрушающих хитин. В последующем большой цикл работ был посвящен и деполимеризации хитозана, в том числе под действием неспецифических ферментов [1], [2] (рис. 3).

Со временем направление работы лаборатории не только не ограничилось получением препаратов для защиты растений и изучением ферментов, но и приобрело более глобальные масштабы, вовлекая в «хитиновое дело» единомышленников. В результате в симбиотические отношения с нашей лабораторией вступили ведущие институты России и ближнего Зарубежья. Изменилось и название лаборатории в связи с расширившимся кругом задач: в 2015 году она была переименована в лабораторию инженерии биополимеров. Нет теперь и Центра «Биоинженерия», он сейчас входит в состав Федерального исследовательского центра биотехнологии РАН и носит название Институт биоинженерии.

Лаборатория сегодня

Несмотря на формальные перемены, неизменными в нашей лаборатории остаются объект исследования, дружественная атмосфера и готовность принять всех желающих в большую «хитиновую семью». В настоящее время она насчитывает 10 человек, семь из которых — молодые сотрудники (рис. 4). Практически каждый из нас занимается своей тематикой в сотрудничестве с другими институтами. О наших исследованиях в родных стенах, а также разветвленной дружественной сети колабораций, я расскажу ниже.

Всегда как дома. Исследования в alma mater

Семь лет назад, волей случая оказавшись в Москве, я и подумать не могла, что лаборатория инженерии ферментов (в дальнейшем биополимеров) станет моим вторым домом. Приехав на несколько месяцев для выполнения дипломной работы, я осталась здесь надолго. И дело здесь вовсе не в тематике (хотя и в ней, конечно, тоже) — подкупила добрая, почти семейная атмосфера. И каким же полезным делом можно заняться в этих родных стенах? Прежде всего, это работы по синтезу производных хитозана: помните сравнение с конструктором «Лего» в начале нашей статьи? Вот именно таким конструированием мы занимаемся дни напролет. Разрезаем хитозан кислотами и ферментами, а затем присоединяем различные заместители, получая полимеры для самых различных задач: от фармацевтики до сельского хозяйства.

Проводятся на нашей базе и исследовательские работы в «наномасштабе». «Нано» они не от того, что не существенны, а вовсе наоборот. Вместе с верным помощником — атомно-силовым микроскопом (АСМ) — Юлия Чудинова чувствует себя и инженером-строителем и ювелиром одновременно, изучая взаимодействие полимерных кирпичиков на уровне молекул (рис. 6).

Взаимодействие хитозана с ИБХ РАН на клеточном уровне

Вот уже на протяжении почти 10 лет продолжается сотрудничество с Институтом биоорганической химии РАН — одним из крупнейших российских научных центров, собравшим под своим кровом десятки ведущих научных коллективов. День и ночь кипит работа в лаборатории клеточных взаимодействий. Под чутким руководством Елены Викторовны Свирщевской я и Татьяна Лялина работаем с клеточными линиями и лабораторными животными, пытаясь раскрыть потенциал хитозана как полимера для создания систем доставки вакцин и лекарств (рис. 7). О преимуществах и недостатках таких систем «биомолекула» неоднократно писала [3–6]. Несмотря на большую популярность данной тематики в последнее десятилетие и «кажущуюся» всестороннюю изученность, данное направление таит много нового и интересного. Совсем недавно (в 2015 году) нам удалось установить, что хитозан и его производные сортируются в клетке в зависимости от заряда полимерной цепи [7]. Так, гидрофобные положительно заряженные хитозаны попадают в митохондрии, в то время как отрицательно заряженные — в лизосомы, при чем происходит нейтрализация их заряда. Чем это может быть полезно? Помимо фундаментального значения — понимания механизмов внутриклеточного транспорта, — это исследование имеет и прикладной аспект.

В настоящее время известно, что ряд заболеваний сопряжен с дисфункцией органелл клетки. Так, часто причиной рака, диабета или рассеяного склероза могут являться именно митохондрии, а поддающиеся только симптоматическому лечению болезни лизосомного накопления — следствие нарушения работы ферментов основного пищеварительного тракта клетки (лизосом). Таким образом, полимеры, способные специфически направить лекарство или генетическую конструкцию в определенную часть клетки, — это уже не мечта, а реальность [8].

В Коми за научным открытием: Коми научный центр УрО РАН

Не страшны нашим работницам полярные ночи и тысячекилометровые трассы. Ради больших научных открытий готова отправиться в долгий путь Мария Коновалова. Вне зависимости от длины светового дня сотрудники Научного центра Коми разрабатывают новые барьерные материалы для хирургии на основе пектина и хитозана. Востребованность таких материалов очень высока, ведь спайки являются важной медицинской проблемой и развиваются примерно у 90% больных, повторно перенесших полостные операции. Спаечный процесс может стать причиной кишечной непроходимости, тазовых болей, последующего бесплодия и внематочной беременности у женщин.

«Преимущество разрабатываемых нами противоспаечных гелей очевидно», — говорит Мария, — «ведь благодаря способности к биодеградации их не нужно извлекать путем повторной операции. Не думайте, что для создания геля подойдет абсолютно любой пектин и хитозан: мы перепробовали десятки комбинаций и лишь одна оказалась эффективной (на основе яблочного пектина и хитозана с высоким содержанием ацетильных групп)».

Вот так кропотлива работа молодых ученых — десятки гелей и сотни прооперированных крыс под покровом полярной ночи все-таки дали положительный результат (рис. 8). Данная работа получила поддержку фонда У.М.Н.И.К., и, возможно, уже в скором будущем у таких гелей появится шанс выйти на рынок хирургических материалов.

Польза хитозанового «плюса»: хитозан и его производные как эффективные гемостатики и антибактериальные агенты

В данной статье уже не раз упоминалось о такой уникальной особенности хитозана как положительный заряд полимерной цепи. Какие же еще преимущества может дать хитозановый «плюс»? Ответ на этот вопрос знает аспирантка лаборатории инженерии биополимеров Бальжима Шагдарова. Ее работа связана с получением производных, несущих положительный заряд даже в физиологических условиях (в отличие от исходного полимера, заряженного положительно только при кислых pH). Благодаря заряду такие полимеры противоположны по действию гепарину, заряженному отрицательно. Пользу такого изобретения вам подтвердит любой хирург, ведь так часто приходится немедленно остановить кровь при хирургических операциях. В экспериментах in vitro и in vivo (совместно с Н.Н. Дрозд из Гематологического научного центра) Бальжиме удалось показать, что производное хитозана работает ничуть не хуже коммерческого аналога — протамин сульфата, при этом оказываясь менее токсичным [9].

Более того, такие производные хитозана являются эффективными антибактериальными агентами, связываясь с отрицательно заряженной мембраной бактерий. Так, совместно с учеными из Казани под руководством С.Н. Куликова (Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора) и Перми (В.П. Коробов из Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН) был показан как собственный антибактериальный эффект хитозана в отношении бактерий рода Staphylococcus, так и их синергетическое действие совместно с антибактериальными агентами белковой природы (лизостафином и варнерином) . Что же мы подразумеваем под синергетическим действием? Использование намного меньшего количества фермента или пептида в комплексе с хитозаном при сохранении высокой антистафилококовой активности (рис. 9). Такой подход имеет существенное преимущество перед классическими антибиотиками вследствие того, что в гораздо меньшей степени вызывает образование резистентности у штаммов стафилококка.

О возможности применения таких белковых молекул для антибактериальной терапии «биомолекула» уже упоминала ранее: «Антимикробные пептиды — возможная альтернатива традиционным антибиотикам» [10].

Хитозановые помощники для имунной системы: сотрудничество с Институтом вакцин и сывороток И.И. Мечникова

Раскрою маленький секрет: хитозан является эффективным адъювантом . Если сказать простым языком — помощником иммунной системы, усиливающим иммунный ответ на вводимый антиген. Такой подход известен ученым еще с конца 19 века и связан с именами Э. Ру и А. Йерсена, обнаруживших усиленную выработку антител при совместном введении дифтерийного антигена в сочетании с хлористым кальцием.

О том, для чего нужны адъюванты, а также о наноструктурных адъювантах, сочетающих функции транспортера и иммуностимулятора, читайте на «биомолекуле»: «Иммуностимулирующие вакцины» и «Вакцинация в контексте „нано“» [6], [11]. — Ред.

С тех пор вот уже почти два века продолжается поиск адъювантов, сочетающих в себе эффективность и безопасность. Так, в группе разработки и изучения адъювантов Института вакцин и сывороток И.И. Мечникова (руководитель Ю.М. Васильев) совместно с Лейсан Хантимировой продолжаются исследования хитозана с различными характеристиками в вакцинах против гриппа (рис. 10) [12]. Коллегами показано, что и в этой области применения хитозан является весьма эффективным, приходя на смену классическим адъювантам на основе сквалена или гидроокиси алюминия. Впереди стандартизация и доклинические исследования таких препаратов.

Ответы на самые частые вопросы о прививках даны в статье «Вакцины в вопросах и ответах» [13]. А подробнее о проблемах разработки «универсальных» противогриппозных вакцин можно узнать из материала «Универсальная вакцина от гриппа — мечты и реальность» [14]. — Ред.

Это далеко не полный список наших сотрудничеств: для детального раскрытия каждого не хватит рамок данной статьи. Лишь перечислю некоторые из них: НИИ фитопатологии, Белорусский государственный университет (биологический факультет), Институт элементорганических соединений им. А.Н. Несмеянова, Московский физико-технический институт. Также нашим бессменным соратником и спонсором является российский производитель хитозана и различных продуктов на его основе OАО «Биопрогресс» (рис. 11).

По секрету всему свету: расскажем всему миру о наших открытиях

Какая же наука без обмена опытом и научных споров с коллегами? Конечно же, мы не сидим на месте и всегда открыты новым городам, странам и континентам! В молодежном отделении нашей лаборатории есть маленькая традиция: фирменное фото на конференциях и мероприятиях, где нам в очередной раз удается побывать вместе. Вот только малая часть из большой коллекции таких фотографий (рис. 12).

Награды, премии, гранты

Конечно же такое сотрудничество было бы невозможно без финансовой поддержки и общественного признания. Лаборатория (за всю историю) является обладателем около 20 грантов РФФИ, РНФ (2016–2018 гг.), ряда других наград и премий, среди которых особенно значимой является премия Правительства Российской Федерации в области науки и техники за 2013 г. (рис.13).

Не отстает от наставников и молодежь. Работа молодых сотрудников была дважды отмечена получением стипендии Президента РФ (стипендиат А. Зубарева), грантами РФФИ и Министерства образования и науки (Д.В. Курек и М.В. Коновалова, А. Зубарева), Шорыгинской премией. Делаем первые шаги и в продвижении наших разработок в практику, являясь победителями программы У.М.Н.И.К. (М. Коновалова, Л. Хантимирова, А. Зубарева). Мы не собираемся останавливаться на достигнутом и активно участвуем во всех проводимых конкурсах.

Когда рабочий день окончен

Конечно же, мы живем не только наукой (хотя и уделяем ей немало времени). У каждого из нас есть свои увлечения, иногда косвенно связанные с хитином. Так, например женская часть нашего коллектива не прочь устроить кулинарный поединок (рис. 14).

Есть среди нас любители конструировать модели военной техники, сочинять стихи, валять из шерсти, рисовать и даже играть на флейте. В настоящий музей переросло увлечение заведующего лабораторией. Его коллекция козлов с музыкальными инструментами насчитывает несколько сотен экземпляров. Подробнее об уникальном музее козла вы можете почитать на сайте «Квакша», который, к слову, также является моим любимым хобби (совместно с Артемом Недолужко). Мы стараемся показать нашим читателем мир «глазами натуралистов», рассказывая популярно о путешествиях (впрочем, не только о них). Созданный в далеком 2004 году сайт по праву можно считать настоящим долгожителем Рунета: несмотря на пертурбации, из-за которых он не работал несколько лет, идея ресурса, популяризирующего активный образ жизни и любовь к Родине, жила в сердцах его создателей. Сегодня «Квакша» превратилась в динамично развивающийся и постоянно обновляющийся туристический портал.

Также сотрудники лаборатории инженерии биополимеров принимают активное участие в различных мероприятиях, проводимых как институтом, так и ФИЦ биотехнологии. А зачастую их и организуют (рис. 15).

Эпилог

Хорошим эпилогом к нашей сегодняшней истории может служить отрывок из поэтического сопровождения к мероприятию «Флешмоб Зарядка», которое прошло в ФИЦ биотехнологии осенью 2015 года. Мы воспользовались случаем и призвали коллег приобщиться к здоровому образу жизни — провели веселую «научную зарядку» на территории института.

Раз-два, три-четыре, три-четыре, раз-два!
Пусть узнают там и тут — всех наш лучше институт!
Нет, наверно, в целом мире веселей, дружней ребят!
Всем готов прийти на помощь хитозановый отряд!
Мы поем, рисуем, пляшем — все занятия хороши!
И, конечно же, науке отдаемся от души!
(Зубарева А.А, отрывок из речевок к флешмобу «Зарядка»)

Послесловие

Надеюсь, благодаря моему обзору вам удалось представить широкий круг задач, стоящих перед нашей дружной лабораторией. Вход в нее всегда открыт, мы с радостью примем в наш коллектив новые целеустремленные лица, готовые активно трудиться и привносить новые идеи в наше большое хитозановое дело. Также мы открыты и новому сотрудничеству и готовы раскрывать новые грани хитина и хитозана в самых различных областях. Ведь, как любит повторять заведующий лабораторией Валерий Петрович Варламов (рис. 16), перефразировав высказывания вождя пролетариата (В.И. Ленина. — прим. автора), «Хитозан неисчерпаем как электрон, в нем каждый может найти свою достойную нишу».

Литература

1. Il’ina A.V. and Varlamov V.P. (2003). Effect of the degree of acetylation of chitosan on its enzymatic hydrolysis with the preparation Celloviridin G20x. Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 39, 273–277;
2. Ilyina A.V., Tatarinova N.Y., Varlamov V.P. (1999). The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii. Process Biochem. 34, 875–878;
3. «Огуречная» мечта;
4. Работа курьером, район — организм;
5. Наномеханика для адресной доставки лекарств – насколько это реально?;
6. Вакцинация в контексте «нано»;
7. Zubareva A.A., Shcherbinina T.S., Varlamov V.P., Svirshchevskaya E.V. (2015). Intracellular sorting of differently charged chitosan derivatives and chitosan-based nanoparticles. Nanoscale. 7, 7942–7952;
8. Sakhrani N.M. and Padh H. (2013). Organelle targeting: third level of drug targeting. Drug Des. Devel. Ther. 7, 585–599;
9. Б. Ц. Шагдарова, Н. Н. Дрозд, А. В. Ильина, Ю. С. Логвинова, В. П. Варламов. (2016). Нейтрализация антикоагулянтной активности гепарина N-[(2-гидрокси-3-триметиламмоний)пропил] хлорид-производными хитозана. Прикл. биохимия и микробиол.. 52, 421-428;
10. Антимикробные пептиды — возможная альтернатива традиционным антибиотикам;
11. Иммуностимулирующие вакцины;
12. Vasiliev Y.M. (2015). Chitosan-based vaccine adjuvants: incomplete characterization complicates preclinical and clinical evaluation. Expert Rev. Vaccines. 14, 37–53;
13. Вакцины в вопросах и ответах;
14. Универсальная вакцина от гриппа — мечты и реальность.