12 биологических методов в картинках

Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

---

Партнер этой статьи — «Гемабанк»

«Гемабанк» — крупнейший лицензированный банк персонального хранения стволовых клеток пуповинной крови в России и Восточной Европе, лидер российского рынка. «Гемабанк» предоставляет услуги персонального хранения стволовых клеток с 2003 года. По состоянию на 2017 год в «Гемабанке» хранится более 26 000 персональных образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови граждан различных стран мира, из них каждый 1000-й образец был успешно применен в терапии.

---

Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?

И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!

Зачем нужны изолированные клетки

Объектом биологических и молекулярно-биологических исследований являются живые организмы, но работа с ними довольно трудна. Во-первых, это дорого и долго. Во-вторых, изучать молекулярные механизмы в живом организме чрезвычайно сложно из-за колоссального числа взаимосвязанных компонентов и низкого разрешения методов анализа: очень сложно выделить эффекты одного изучаемого процесса из миллионов других событий, происходящих в том же организме в то же время. В-третьих, на самой интересной живой системе — человеке — эксперименты и вовсе запрещены. Поэтому ученым приходится исследовать организм по частям, что имеет несомненные преимущества, но и существенные ограничения.

Составными частями организма являются органы, которые в свою очередь состоят из тканей, а те — из клеток (рис. 1). В настоящее время исследователи учатся создавать трехмерные тканевые структуры [1–3], но до выращивания полноценных органов in vitro пока далеко. Выделение отдельных органов и поддержание их жизнедеятельности вне организма пока более сложная задача, чем их исследование в составе организма.

Поэтому наиболее распространенным модельным объектом молекулярно-биологических исследований в наше время являются клеточные культуры. Клеточная культура — это клетки (как правило, клетки животных или человека, принадлежащие одной ткани), выращиваемые обычно в пластиковых флаконах, планшетах или чашках Петри в специальной питательной среде при контролируемых температуре, влажности и уровне углекислого газа (рис. 2). Клеточные культуры многочисленны, разнообразны, доступны, относительно просто культивируются. Для них легко контролировать внешние условия и воздействовать изолированными стимулами, а для анализа имеется богатый арсенал методов. Многие методы при работе с клетками позволяют получить принципиально новую информацию, нежели при изучении организма, срезов или гомогенатов ткани. Так, например, один из основных методов анализа клеток — флуоресцентная микроскопия [4] — позволяет в живых культивируемых клетках «увидеть» единичные молекулы с пространственным и временным разрешением в несколько десятков нанометров и микросекунд соответственно .

Это на 4–6 порядков лучше разрешения методов рентгеновской томографии и МРТ и на 2–3 порядка — прижизненной оптической микроскопии мелких прозрачных животных (рыбок «зебра», личинок насекомых, эмбрионов ранних стадий).

Помимо этого, культуры клеток нашли широкое применение в биотехнологиях, производстве лекарств и вакцин. За последние 10 лет запущено около тысячи клинических испытаний протоколов клеточной терапии (то есть пересадки клеток для лечения заболевания), для некоторых из которых уже доступны результаты (на сайте clinicaltrials.gov и по ссылкам на странице исследования). Очевидно, что за клеточной терапией будущее, и она откроет медицине недоступные прежде рубежи.

А на рисунке 3 показана краткая история развития клеточных технологий.

Клеточные культуры: как их получать и для чего использовать?

Биомолекулы, клетки и организм: части и целое

Прежде чем перейти к методам, рассмотрим, что собой представляют клетки in vitro и чем они отличаются от клеток в составе организма. Это важно, так как конечная цель экспериментов на клетках — понимание молекулярных механизмов функционирования именно организма, а не клетки. Переход от клеток к организму гораздо сложнее, чем может показаться на первый взгляд. По ходу статьи мы еще будем возвращаться к этому вопросу, а сейчас рассмотрим некоторые общие моменты.

Введение в сами понятия in vivo и in vitro можно найти в статье «In vivo — in vitro — in silico» [10].

Живой объект состоит из более мелких составных частей: органов, тканей, клеток, органелл, биомолекул и одновременно является частью более масштабных систем — таких как пищевые цепочки, экосистемы, сообщества. Еще Гиппократ и Аристотель задавались вопросом соотношения целого и его частей и сошлись в понимании, что целое есть больше, чем сумма частей. Однако современная наука почти полностью полагается на альтернативный принцип — редукционизм, — в соответствии с которым познание целого осуществляется через познание его составных частей. При таком подходе теряются связи между частями, в нашем случае — между клетками. Хотя каждая клетка есть тоже, по сути, целое, но вне организма это уже не совсем та клетка, что была в его составе. Что меняется при таком переходе?

Наглядной иллюстрацией служат слизевики [11]. Эти одноклеточные обладают способностью объединяться из десятков тысяч клеток в плазмодий, который в поисках еды может быстро передвигаться и выбрасывать споры на большое расстояние, а потом вновь распадаться на отдельные клетки (видео 1). Многие бактерии тоже обладают способностью формировать плотные конгломераты — биофильмы, или биопленки, в которых внутренние клетки защищены внешними от окружающей среды. То есть объединение в многоклеточные структуры приводит к возникновению новых функций, отсутствующих у отдельных клеток. Конкурентные преимущества за счет приобретения новых способностей послужили причиной объединения одноклеточных организмов в многоклеточные около 1 млрд лет назад [12].

В многоклеточных организмах клетки существуют в неразрывной связи друг с другом на протяжении сотен миллионов лет эволюции и за это время полностью перестроились на выполнение конкретных функций. Спектр экспрессируемых клеткой генов, ее функции и активность, форма и размер, скорость деления и гибель регулируются связями с другими клетками организма. У млекопитающих эта связь основана на всевозможных сигналах: химических (гормоны, цитокины, ростовые факторы, питательные вещества, производные кислорода, ионы металлов и др.), механических и электрических (передаваемых нейронами) (рис. 4).

Межклеточная коммуникация лежит в основе процессов, изучаемых почти всеми медицинскими дисциплинами, в частности эндокринологией, неврологией, кардиологией, гематологией и др., но о полной расшифровке этих взаимодействий пока говорить не приходится. Если у клетки в организме нарушаются нормальные связи с окружением, она либо умирает (для этого существуют специальные механизмы самоуничтожения — апоптоз и аноикис), либо становится «асоциальной», то есть раковой. При выделении из организма и переносе в чашку Петри клетки тоже теряют почти все внешние связи, но в благоприятных условиях некоторое время живут и делятся (однако могут стать и раковыми).

В новых, искусственных условиях клетки сохраняют лишь геном, а все остальные свойства меняются — размер, скорость роста, экспрессия генов, функциональная активность, чувствительность к лекарствам, метаболизм, состав мембран и другие. В связи с этим сегодня ведется активный поиск условий in vitro, которые максимально воспроизводят условия in vivo. Большинство тканей организма содержат несколько типов клеток, имеют сложную структуру внеклеточного матрикса и пронизаны сетью сосудов и нервов (рис. 5). Полностью воссоздать такую архитектуру in vitro пока невозможно, а значит, и клетки в культуре пока остаются лишь приближением к клеткам в составе организма.

Выделение и культивирование клеток

Источником клеток может быть любая ткань организма. В большинстве тканей клетки находятся внутри так называемого внеклеточного матрикса, который разделяет ткань на области и формирует ее архитектуру (рис. 5 и 6) [13]. Внеклеточный матрикс состоит из белков, образующих фибриллы: коллагена, фибронектина, эластина и протеогликанов с длинными полисахаридными ветвями (гликозаминогликанами). Последние великолепно удерживают жидкость и формируют в бoльшей части внеклеточного пространства так называемый гидрогель. В случае кости матрикс формируется из кристаллизованного фосфата кальция [14]. Самый распространенный из белков человека — коллаген: он составляет до 30% массы всех белков организма. Компоненты матрикса синтезируются многими клетками, но специализируются на этом фибробласты.

Для выделения клеток необходимо разрушить внеклеточный матрикс и разорвать связи между клетками, после чего клетки «рассыпаются» (рис. 7). Клеточную культуру можно получить и другим способом: поместив в культуральную среду кусок ткани целиком, и тогда часть клеток постепенно выползет и засеет окружающее пространство. Такой тип культуры называется эксплантом. Выделение и манипуляции с клетками обычно проводят в специальном стерильном боксе — ламинарном шкафу (рис. 8а).

У некоторых тканей нет внеклеточного матрикса или клетки не связаны с ним, что существенно упрощает процедуру выделения. Это относится, главным образом, к клеткам крови и их предшественникам, находящемся в костном мозге. Благодаря легкости выделения и сохранности поверхностных молекул для этих клеток наиболее хорошо изучено разнообразие типов и пути их формирования из стволовой клетки крови (гемопоэтической СК).

После выделения клетки помещают в питательную среду и растят в чашках Петри или флаконах в атмосфере углекислого газа (5% CO₂) и близкой к 100% влажности в CO₂-инкубаторах (рис. 8б). Питательная среда состоит из физиологических солей, буфера pH, аминокислот, витаминов и глюкозы, а также белковых ростовых и питательных факторов (см. врезку ниже). Добавляемый к среде индикатор феноловый красный позволяет визуально контролировать pH и придает среде красный цвет.

После выделения клетки в течение нескольких часов (до суток) восстанавливаются от стресса («ремонтируют» мембрану, восстанавливают отрезанные ферментами рецепторы) и затем начинают приспосабливаться к новым условиям (прикрепляются к доступным поверхностям, переходят на новый режим метаболизма, изменяют форму и экспрессию генов и т.д.). Исключением являются клетки крови и кроветворные клетки из костного мозга, которые выделены без использования ферментов и могут быть проанализированы сразу после выделения. В культуре некоторые клетки крови тоже могут прикрепляться к поверхностям, активироваться и активировать другие клетки. Эти изменения можно затормозить (они ведь неестественные и искажают нормально происходящие в клетках процессы), если поддерживать клетки в суспензии, не давая им прикрепляться за счет использования специальных поверхностей, полужидких сред или постоянного покачивая.

При необходимости запечатлеть клетки в их нативном состоянии, исследования желательно проводить в первые сутки после выделения: за это время клетки еще не успеют сильно изменить свой первоначальный облик. Хотя для этих целей обычно работают со срезами тканей, клетки, в отличие от срезов, дают возможность использовать прижизненную микроскопию и цитометрию. Стоит отметить, что микроскопию уже научились проводить и на живых животных (интравитальная микроскопия — рис. 6, а также видео из статьи «Иммунитет: борьба с чужими и... своими» [15]), но разрешение и возможности этого подхода пока ограничены. Для большинства других задач клетки поддерживают в культуре и анализируют спустя более длительное время после выделения.

Разновидности клеточных культур

Клеточные культуры различают по их источнику, наличию общего предка, способности клеток размножаться, прикрепляться к поверхности, образовывать многоклеточные конгломераты и др.

В лабораторной практике наиболее распространены раковые клетки. Они не имеют предела числа делений, будучи фактически бессмертными, что позволяет наращивать их в неограниченном количестве. Поскольку при постоянном росте клеток место в чашке Петри (или в объеме культуры) периодически кончается, время от времени их нужно пересевать: откреплять от поверхности, разбивать клеточные скопления с помощью ферментов и ЭДТА (хелатор кальция), а потом заново сеять в меньшей плотности, что позволяет им размножаться дальше. Эта процедура называется пассированием, а возраст культуры часто считают по числу таких пассажей.

Через несколько пассажей после выделения из опухоли раковые клетки полностью вытесняют все остальные и становятся однородными. Такие культуры называют клеточными линиями или линейными клетками. Возможно, самой распространенной клеточной линией сегодня является линия клеток рака шейки матки HeLa (рис. 9), полученная в 1951 г. от пациентки Генриетты Лакс, умершей вскоре после взятия этих клеток [6].

Раковые клетки даже в организме сильно отличаются от нормальных, а в культуре это отличие только увеличивается. Так, многие раковые линии имеют увеличенный набор хромосом (анеуплоидия), что делает их более устойчивыми к повреждению ДНК. Кроме этого, многие типы раков вызваны вирусными инфекциями, передающимися и клеточным культурам, что не позволяет использовать эти клетки в производстве вакцин (см. ниже). В связи с этим в фармакологии и научных исследованиях широко востребованы линии «нормальных» — не раковых — клеток.

Именно производство вакцин послужило основным мотивом получения культуры «нормальных» клеток. С этой целью Леонард Хейфлик (рис. 10б) выделял клетки из абортивного материала и обнаружил наличие предела числа делений клеток в культуре, получившего название предела Хейфлика [16]. Для человеческих клеток этот предел составляет 50–70 делений и обусловлен укорочением теломер — фундаментальным механизмом старения клеток.

В 1965 году Хейфлик получил линию фибробластов легкого WI-38 (рис. 10а), которая смертна, но была наработана и заморожена в достаточным количестве, чтобы обеспечить исследования по всему миру и по сегодняшний день [17]. Благодаря человеческому происхождению, отсутствию вирусных инфекций и раковой трансформации эта линия нашла широкое применение в производстве вакцин. Сейчас, однако, фармкомпании опасаются, что конечный ресурс данной линии не позволит им завершить начатые исследования, и переходят на другие линии. В настоящее время эта линия широко используется для изучения молекулярных механизмов старения [18].

Некоторым компромиссом между раковыми и нормальными являются иммортализованные клетки: полученные из нормальной ткани, они приобрели способность к неограниченному числу делений. Такой переход к бессмертию может происходить либо спонтанно, либо в результате искусственного введения определенных генов или слияния с раковыми клетками, как в случае гибридoм. «Бессмертие» клеткам могут придать онкогены: большой Т-антиген вируса SV40, H-Ras, c-myc, E1A. Эти гены по сути вызывают опухолевую трансформацию клеток со всеми вытекающими недостатками (нестабильность генома, потеря физиологических функций и т.д.). Наиболее деликатный и получающий все большее распространение способ иммортализации — это введение в клетку гена теломеразной обратной транскриптазы (TERT) , которая достраивает теломеры и предотвращает их укорачивание при делении (рис. 11). За открытие теломеразы в 2009 году была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине.

Хотя такая трансдукция тоже является, по сути, онкогенной, она позволяет лучше сохранить физиологические функции и меньше дестабилизировать геном по сравнению с трансдукцией другими онкогенами. Также стоит отметить, что этот метод работает не для всех клеток: например, он не подходит для Т- и B-клеток.

Дифференцированные клетки (которые приобрели свою конечную специализацию) составляют бoльшую часть клеток организма и практически не делятся. Будучи основными составляющими и «рабочими лошадками» во всех органах и тканях, они служат мишенью действия большинства лекарств, что делает их весьма востребованными для исследований. В культуре их можно получить путем направленной дифференцировки плюрипотентых стволовых клеток [5] в нужный тип клеток (см. далее), однако этот путь имеет существенные технические и, в случае человеческих клеток, еще и этические сложности.

Наиболее распространенными культурами дифференцированных клеток являются первичные клеточные культуры — клетки, выделенные из зрелой ткани и не пассированные in vitro (рис. 12). Число делений таких клеток критически зависит от условий культивирования, но редко составляет более 5–10 раз. Исключением являются стволовые, прогениторные и некоторые специализированные клетки, например, активированные Т- и B-лимфоциты. Кроме того, при длительном культивирование первичная культура склонна к замещению фибробластами.

Многие исследования выполняются именно на первичных клеточных культурах, обладающих рядом преимуществ по сравнению с раковыми и иммортализованными клетками:

1. Они гораздо лучше соответствуют клеткам in vivo: нейроны проводят электрические импульсы, гепатоциты секретируют альбумин, макрофаги фагоцитируют бактерии и т.д.
2. Если говорить о клетках животных, они легко доступны при наличии вивария — остается лишь получить их (что, впрочем, довольно трудоемко). Доступность человеческих клеток определяется типом ткани: распространены культуры эндотелиальных клеток из пуповинной вены (HUVEC, рис. 12г) и мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани, источниками которых служат побочные продукты акушерства и хирургии соответственно.
3. Они несут генотип донора, а поэтому могут использоваться для изучения причин патологий конкретного пациента на молекулярном уровне.

Культуры клеток человека, мыши, крысы, кролика и других животных собраны в коллекциях, хранящихся в жидком азоте при температуре −196 °C (рис. 13а). Наиболее полная коллекция — ATCC в США — насчитывает более 4600 клеточных культур эукариот. В МГУ сейчас создают уникальный по своим масштабам депозитарий живых систем «Ноев ковчег», в котором среди всевозможных образцов живых объектов есть и клетки животных и человека (рис. 13б). Некоторые институты тоже имеют свои коллекции: например, в ИБХ РАН коллекция организована по принципу облачного хранилища с общим журналом и клетками, распределенными по разным лабораториям.

Линии клеток из коллекций можно купить; они существуют почти для каждого типа опухоли и здоровой ткани и детально охарактеризованы. Это позволяет подобрать наиболее подходящие для конкретного исследования линии и сравнивать результаты с полученными ранее в своей или в других лабораториях.

Использование клеток в научных исследованиях

Клеточные культуры являются прежде всего инструментом для научных исследований. Какие возможности дает этот инструмент и для чего его можно использовать? Для клеток в культуре имеется богатый арсенал методов манипуляции и анализа: некоторые входят в 12 методов настоящего спецпроекта, а о многих других рассказывают отдельные статьи на «Биомолекуле». Здесь мы кратко остановимся на основных, но перед этим обсудим уникальные преимущества клеточных культур как модельных объектов.

В отличие от клеток в организме, для клеток в культуре исследователь полностью определяет внешние условия. Хотя эти условия часто и не соответствуют условиям in vivo, воспроизводимость и контроль позволяют ставить точные эксперименты и выявлять ответ клеток на определенные стимулы. Для изучения внутриклеточных процессов эта возможность уникальна, но надо помнить, что, чем сильнее клетки в культуре отличаются от клеток в организме, тем больше вероятность, что механизмы этих процессов тоже будут отличаться.

В клетке находится отнюдь не разбавленный раствор, используемый в биохимических и структурных исследованиях, а очень плотное и насыщенное микроокружение (crowded environment) (рис. 14 и видео 2). Как следствие, активности молекул в искусственном растворе и «в жизни» иногда отличаются на несколько порядков. Именно поэтому клетка является гораздо более адекватной моделью при изучении активностей и взаимодействий биомолекул и при анализе воздействия потенциальных лекарств на молекулы-мишени в фармакологии.

Как доставить ген в клетку?

Если интересующая нас молекула — белок, то самый простой способ поместить его в клетку и изучить — это заставить его синтезироваться прямо «на месте», введя внутрь клетки ген этого белка. Существует множество методов доставки генов в клетки (рис. 15) [19], как на основе чисто физико-химических принципов (трансфекция), так и с использованием вирусов в качестве носителя (трансдукция).

Эффективность трансфекции существенно зависит от типа клеток и методики: для раковых и иммортализованных клеток это обычно 30–80%, однако для первичных клеток — редко более 10%. Исключением является метод электропорации, который иногда позволяет добиться высокой эффективности доставки генов в первичные культуры. Химические методы трансфекции не предназначены для встраивания введенного гена в геном клетки, и со временем введенная ДНК теряется .

Небольшая доля ДНК все-таки может закрепиться в геноме при трансфекции и передаваться по наследству, что позволяет получить линию со стабильной экспрессией введенного гена. Отбор ведется путем селекции таких клеток по устойчивости к антибиотику (вместе с исследуемым геном обычно вставляют и ген, обеспечивающий такую устойчивость) или с помощью нескольких циклов клеточной сортировки.

Методы вирусной трансдукции имеют ряд преимуществ перед трансфекцией: высокая эффективность в отношении первичных клеточных линий, возможность встраивания гена в геном, применимость in vivo и избирательность действия вирусов на определенные типы клеток и тканей.

Для трансфекции создают искусственные вирусные частицы, снаружи похожие на натуральные вирусы и проникающие в клетку по тем же механизмам. Но внутри вместо части собственной ДНК они несут нужные исследователю гены и лишены программы саморепликации (то есть, такие частицы не заразны). Сегодня широко применяется около десятка генно-инженерных конструктов на базе различных вирусов. Для изменения избирательности вирусных частиц они могут быть дополнительно модифицированы заданными поверхностными молекулами.

Отредактируй это

Сейчас возможности клеточных технологий выходят на новый уровень после недавнего прорыва в методах редактирования генома на основе системы CRISPR/Cas-9 [20]. Методика уже активно используется, и в продаже имеются наборы для избирательного удаления определенных генов из клеток (генетический нокаут). Преимуществом CRISPR/Cas-9 является простота по сравнению с доступными прежде методами редактирования генома (цинковыми пальцами, TALEN) [21]. С помощью CRISPR/Cas-9 можно не только удалять и выключать гены, но и менять их и восстанавливать. На CRISPR/Cas-9 сегодня возлагают большие надежды в лечении моногенных наследственных заболеваний [22].

Да будет свет

Относительная простота введения желаемых генов в клетки открывает доступ к богатым возможностям, пожалуй, самого мощного на сегодня инструмента молекулярной биологии — генетически кодируемых флуоресцентных белков [23]. Они позволяют отслеживать отдельные клетки в организме и даже молекулы в клетках, окрашивать определенные органеллы, изучать межмолекулярные взаимодействия и конформацию белков, измерять концентрации вторичных посредников (Ca²⁺, H₂O₂, цАМФ, H⁺, АТФ/АДФ, НАДН и др.), визуализировать и определять активность различных белков [24].

Помимо этого, в последние пять лет широкое распространение получила оптогенетика — метод, в котором с помощью генетически кодируемых светочувствительных белков можно управлять клеточными процессами с высоким временным и пространственным разрешением, буквально посветив в нужную область лазером (рис. 16) [25].

Флуоресцентные белки и оптогенетика проявляют весь свой потенциал в связке с современными методами флуоресцентной микроскопии [4]. Эти методы достигли чувствительности единичных молекул при пространственном разрешении в несколько десятков нанометров, а при временнoм — до нескольких десятков микросекунд (рис. 17). Хотя такое пространственное разрешение и ниже, чем у электронной микроскопии, наличие временнoго разрешения (то есть применимость к живым клеткам) и возможность анализировать одновременно несколько молекул делают методы оптической микроскопии уникальными для широкого круга задач.

Типирование и сортировка

Еще одним мощным методом, который применим только к клеткам in vitro и ex vivo (сразу после выделения), является проточная цитометрия — поштучное исследование клеток в потоке жидкости: клетки по одной проходят через луч лазера, а специальные детекторы ловят сигнал флуоресценции и светорассеяния от освещенной лазером клетки. В отличие от микроскопии, она является исходно количественным методом, то есть позволяет точно измерить интенсивность флуоресценции и обладает высокой производительностью: скорость обработки достигает миллиона клеток в минуту. Это позволяет проводить «перепись» гетерогенных клеточных популяций, коими являются все первичные клеточные культуры. В частности, ей нет альтернатив при идентификации, подсчете и сортировке редких в популяции клеток, таких как стволовые клетки или антиген-специфичные лимфоциты, которых может быть лишь несколько клеток на миллион. Наибольшее распространение цитометрия нашла в иммунологии для анализа субпопуляций лейкоцитов без перевода их в культуру. Важной разновидностью цитометрии является клеточная сортировка в потоке, которая позволяет не только анализировать, но и выделять отдельные субпопуляции из гетерогенных клеточных смесей с чистотой более 99%.

От клеток к организму с помощью стволовых клеток

До этого мы рассматривали традиционные методы работы с клетками, многие из которых предложены во второй половине прошлого столетия. В то время это были передовые технологии, которые впоследствии внесли существенный вклад в развитие биомедицинской науки и молекулярной биологии, а сейчас являются частью обыденной лабораторной практики. Сегодня передовые клеточные технологии позволяют достичь впечатляющих результатов. Однако в научных и, в особенности, научно-популярных статьях авторы часто склонны преувеличивать масштаб открытия и замалчивать сложности и ограничения. Это создает несколько искаженную картину, в которой уже сегодня где-то есть врачи, которые печатают органы на 3D-принтере, избавляют людей от ВИЧ и слепоты и способны вылечить практически любой рак. Действительно, успехи клеточных технологий позволяют надеяться, что это и правда станет возможным в будущем, но пока ведущие специалисты призывают не торопиться с прогнозами, поскольку организм и ткань гораздо сложнее, чем просто сумма составляющих клеток.

Эмбриональные стволовые клетки

В начале XX века Александр Максимов обнаружил, что клетки происходят от единого предка — стволовой клетки (СК) [5]. С того времени ученые постоянно искали СК в надежде научиться управлять их дифференцировкой и получать определенные ткани, а если повезет, то и органы. Было очевидно, что искать такие клетки нужно именно на ранних стадиях развития организма. Так, Хейфлик использовал абортивный материал, в котором, однако, клетки уже приобрели специализацию и пошли каждая по своему пути развития. Другие же брали эмбрионы животных и человека на более ранних стадиях в надежде получить стволовые клетки, которые еще не определились с направлением развития.

В первых экспериментах в 1970-х годах удавалось получить клетки, которые поддерживались в культуре как минимум год, но они существенно отличались от исходных клеток зародыша, не давали желаемой дифференцировки в клетки трех зародышевых листков и развивали хромосомные аномалии (то есть превращались в раковые [28]). После нескольких лет оптимизации условий культивирования в начале 1980-х ученым удалось подобрать условия, обеспечивающие поддержание мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в недифференцированном состоянии [29]. Потребовалось еще 17 лет экспериментов с ЭСК грызунов и приматов, прежде чем в 1998 г. удалось получить первые линии эмбриональных стволовых клеток человека (рис. 18) [30]. Для поддержания таких клеток в недифференцированном состоянии их выращивают на фидере — слое из эмбриональных фибробластов, убитых радиацией. На фидере ЭСК образуют характерные колонии, называемые эмбриоидными тельцами (рис. 16), а при его отсутствии — начинают спонтанно дифференцироваться, причем этот процесс с трудом поддается контролю.

Получение человеческих ЭСК дало ясную перспективу их использования в медицине и положило начало огромной волне исследований по управлению их дифференцировкой. Основной целью получения дифференцированных клеток из ЭСК является их использование для репарации поврежденных тканей. ЭСК также нашли широкое применение в фармакологии в качестве источника нормальных человеческих клеток разных типов для тестирования лекарств. Еще одна важная миссия ЭСК — вклад в понимание процессов дифференцировки, регенерации и репарации, что может быть использовано для активации собственного регенеративного потенциала организма.

Однако пока что терапия стволовыми клетками сопряжена с большим количеством проблем. Введение недифференцированных ЭСК в организм вызывает образование тератом (опухолей из всех типов ткани). Использование дифференцированных ЭСК тоже пока сопряжено с некоторыми сложностями, причем не только этического и юридического характера. Во-первых, эмбриональные стволовые клетки иммунологически не идентичны реципиенту, а значит, их подсадка вызывает иммунный ответ. Во-вторых, в культуре ЭСК часто присутствуют недодифференцированные клетки, которые при выведении могут вызвать образование опухолей. Эти проблемы поддаются решению путем тщательного отбора и очистки вводимого клеточного препарата, что, однако, существенно усложняет весь процесс. В-третьих, простое введение клеток не обеспечивает их правильной локализации в ткани, формирования полноценного внеклеточного матрикса и приобретения нужной активности. Терапевтический эффект от введения, безусловно, есть, но полного восстановления поврежденной ткани или утерянной функции достичь пока не удается.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Грандиозным прорывом в области клеточных технологий после открытия ЭСК стала возможность перепрограммирования зрелых дифференцированных клеток организма в плюрипотентные стволовые клетки, названные индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК, или iPSC, рис. 19). «Биомолекула» много писала об этом и последовавших за ним открытиях [8], [9], [31–33]. Не вдаваясь в детали получения ИПСК, отметим лишь их основные особенности:

1. ИПСК получают без использования эмбрионов, что снимает множество этических ограничений.
2. ИПСК можно получить от самого пациента, что позволяет обеспечить полную иммуносовместимость.
3. Существуют протоколы получения ИПСК, в которых факторы перепрограммирования экспрессируются временно (не встраиваясь в геном), что снижает риск возникновения онкогенных мутаций.
4. ИПСК генетически идентичны донору и могут быть использованы в качестве in vitro модели для изучения индивидуальных молекулярных механизмов патологии и для персонализированного подбора лекарств.

Очевидно, что столь передовая технология на раннем этапе развития имеет множество сложностей технического характера. В оригинальной работе Такахаши и Яманаки эффективность репрограммирования клеток четырьмя «факторами Яманаки» (см. «Была клетка простая, стала стволовая» [8]) составляла всего лишь 0,02%, а время образования колоний — 16 дней [34]. При использовании аденовирусов, которые позволяют избежать модификации генома клеток, эффективность падала еще на порядок [31]. Впоследствии исследователи в разных лабораториях сумели увеличить эффективность почти до 100% и ускорить образование колоний до 7 дней [35]. Этого достигли за счет снижения стабильности генома, но остается вопрос, насколько безопасны такие модификации с точки зрения возможной онкогенной трансформации.

3D-культуры

Как уже было сказано, один из наиболее распространенных способов направленной дифференцировки ЭСК и ИПСК — формирование трехмерных эмбриоидных телец на фидере из фибробластов. Без фидера можно обойтись, если выращивать клетки в висячей капле, например, на крышке чашки Петри (рис. 20а). Следует сказать, что такой метод был весьма распространен в начале и середине XX века для выращивания тканевых эксплантов и эмбриональных клеток, поскольку обеспечивал сохранность структуры ткани, длительность культивирования и удобство наблюдения с помощью прямого микроскопа. Наиболее распространенный подход такого культивирования был предложен все тем же Максимовым и заключался в использовании стекла с выемкой и двух покровных стекол (рис. 20б). Для запуска дифференцировки телец в заданные ткани используют определенные наборы морфогенов и ростовых факторов, добавляемые по четкой программе, после чего клетки заключают в специальный гель, имитирующий внеклеточный матрикс (Matrigel). Оказалось, что стимулированные таким образом тельца обладают удивительной способностью воспроизводить характерную для целевой ткани трехмерную структуру (рис. 21), формируя органоиды. Они открывают уникальные возможность изучения механизмов формирования трехмерных тканевых структур, что практически невозможно с использованием животных. На сегодняшний день описано создание органоидов кишечника, мозга, печени, почки и молочной железы [1], [36].

Применение в биомедицине

Производство вакцин

Именно производство вакцин активизировало развитие клеточных технологий в 1950–1960-х годах. Первая вакцина, произведенная в линии клеток человека — против краснухи (1970 год). Для ее создания Стэнли Плоткин заражал клетки WI-38 вирусом и растил их при 30 °C [37], что позволило отобрать штамм вируса, приспособленный именно к этой температуре, а не к физиологическим 37 °C, при которых вирус погибал. Сегодня крупномасштабное производство вирусных частиц в клеточных линиях осуществляется в биореакторах, которые еще называют ферментерами (рис. 22 и 23).

Биотехнологическое производство белков

Аналогично вирусам клетки могут производить и отдельные белки, но, в отличие от вирусов, белки не способны сами себя воспроизводить в клетках. Чтобы клетка начала производить нужный белок в нее необходимо внедрить ген этого белка (см. раздел «Как доставить ген в клетку?»). В этом заключается суть биотехнологического производства, при котором клетки программируются на генетическом уровне на выработку того или иного белка. Полученные таким образом белки называют рекомбинантными.

Сегодня наиболее распространенный тип клеток, используемый для производства рекомбинантных белков, — клетки бактерий, а именно кишечная палочка Escherichia coli (рис. 24а). Преимуществами этих клеток являются: быстрая скорость размножения (около 30 мин), высокая плотность культуры, простой состав питательной среды и большое удельное количество производимого белка на клетку. Как следствие, бактерии обладают намного большей производительностью и меньшей конечной стоимостью продукта, по сравнению с остальными типами клеток.

Бактерии, однако, способны правильно производить далеко не всякие белки. Дело в том, что конвейер по производству белков в бактериях существенно проще, чем у других, более сложных организмов. Во-первых, для сворачивания длинной полипептидной нити в правильную трехмерную форму в клетке присутствуют специальные помощники — шапероны, а у бактерий этих шаперонов меньше и они отличаются от эукариотических. Во-вторых, у бактерий отсутствует стадия пост-производственной доработки белков, на которой видоизменяются некоторые участки, навешиваются сахара и липиды и удаляются вспомогательные последовательности. В-третьих, многие белки (например, антитела) для правильного функционирования требуют объединения фактически нескольких белков (субъединиц) в один, а бактерии не могут этого сделать с чужеродными для них белками. И, наконец, высокая плотность нарабатываемого белка в бактериях является губительной для многих белков, и они выпадают в осадок. Это ограничивает использование бактерий лишь производством относительно простых белков.

Для производства сложных белков предпочтительно использовать клетки, наиболее похожие на те, которые производят их в естественных условиях. Так, для производства антител используют гибриды B-клеток (см. дальше). Для производства человеческих рекомбинантных белков сейчас используют несколько клеточных линий, условия культивирования и питательные среды для которых подобраны так, чтобы обеспечить максимальный выход продукта. Наиболее распространенной линией является линия клеток яичника китайского хомячка CHO (рис. 24в), которая может расти как прикрепившись к поверхности, так и в суспензии. Вполне естественно, что за качество надо платить. Количество белка, получаемого из литра среды клеток млекопитающих, примерно в 10 раз ниже, чем из литра бактерий, а его производственная стоимость возрастает в десятки раз.

Некоторым компромиссом между клетками млекопитающих и бактериями являются дрожжи (рис. 24б), которые почти так же быстро делятся, как и бактерии (~2 ч) и тоже не очень требовательны к питательной среде. Дрожжи, как и человеческие клетки, — эукариоты (имеют клеточное ядро) и обладают аппаратом, необходимым для полного цикла производства человеческих белков. Однако многочисленные мелкие отличия этого аппарата у дрожжей и млекопитающих требуют оптимизации процесса для каждого отдельного белка. Это, наряду с невысоким выходом продукта, делает дрожжи не самой распространенной биотехнологической системой. Другими возможными альтернативами клеткам млекопитающих являются клетки насекомых и растений.

Наибольшая часть разрабатываемых сегодня терапевтических препаратов — это рекомбинантные белки, и около 60% из них производится именно в клетках млекопитающих. В 2016 году из 10 лидирующих по суммам продаж препаратов 7 являются рекомбинантными белками, а 5 из них произведены в клетках CHO (см. таблицу). В этом списке преобладают рекомбинантные антитела, что обусловлено относительной предсказуемостью их активности. В отличие от большинства других биологически активных молекул, антитела взаимодействуют только с одной мишенью, которую они связывают с исключительной избирательностью и прочностью, в результате чего просто ее «выключают». Стоит отметить, что выключение отдельной молекулы лишь инициирует биологический эффект, который развивается под влиянием множества факторов и остается во многом «черным ящиком». С этим связаны многочисленные противоречия в механизмах действия данных препаратов.

Получение рекомбинантных антител все еще довольно трудоемко, и поэтому для большинства задач антитела производят с помощью гибридoм.

Производство антител в гибридoмах

Антитела вырабатываются B-лимфоцитами в ответ на иммунизацию, то есть введение в организм антигена. Антитела можно выделить непосредственно из плазмы крови иммунизированного животного, которая содержит примерно 10 мг/мл антител. Антитела из плазмы крови называют поликлональными и широко применяют для научных исследований, однако для клинической диагностики они не годятся по двум причинам: 1) они не стандартизованы и 2) для клинической диагностики обычно нужна пара разных антител на один антиген. С целью получения таких стандартизованных антител необходимо выделить отдельные В-клетки, производящие антитела [7]. Эти клетки выделяют из селезенки иммунизированной мыши, переводят в культуру и иммортализируют, сливая с клетками миеломы, получая гибридoмы (рис. 25).

Клеточная терапия

Применение клеток в лечении — клеточная терапия — имеет довольно долгую историю. На своей заре эти методы не имели почти никаких юридических ограничений, поскольку применялись крайне редко, а научный прогресс существенно опережал законотворчество. Еще в XVII веке Жан-Батист Дени переливал кровь от овцы человеку. Гематология и по сегодняшний день является областью, где наиболее часто используют методы клеточной терапии. Точнее, преимущественно один метод — трансплантация кроветворных (гемопоэтических) СК после химиотерапии (рис. 26).

Естественно, пересаживать пытались не только клетки крови, но и другие клетки, причем, в основном, от животных (ксеногенная трансплантация) или от других доноров (аллогенная трансплантация). В результате этих экспериментов появились случаи с летальным исходом, и в 1980-х годах клеточная терапия была запрещена в некоторых странах, а в других — обрела законодательные рамки. Запрет не коснулся хорошо зарекомендовавших себя подходов.

Широкое применение нашли мезенхимальные стволовые клетки (МСК), впервые открытые нашим соотечественником Александром Фриденштейном в 60-х годах прошлого столетия. МСК называют клетки соединительной ткани, способные дифференцироваться в клетки костной, хрящевой и жировой тканей (как обязательное условие, хотя и не только в них). МСК продемонстрировали высокую эффективность при регенерации указанных типов тканей, а также некоторых других. Стоит отметить, что регенеративный эффект МСК обусловлен не столько приживлением самих трансплантируемых клеток, сколько выделяемыми ими веществами и микрочастицами, которые стимулируют регенеративную активность собственных стволовых клеток. Такая особенность открывает возможность создания аптечной формы «лекарства» для активации регенерации на основе выделяемых МСК факторов.

Другим распространенным клеточным продуктом являются клетки пуповинной крови, которые содержат большое количество клеток на ранних стадиях дифференцировки и не успели накопить генетических ошибок. Эти клетки можно использовать вместо костного мозга, не нанося травму при выделении. Однако в протоколах для костного мозга необходимо больше клеток, чем есть в крови одной пуповины, что требует разработки специальных протоколов для клеток пуповинной крови. Сегодня ведется довольно много клинических исследований протоколов для лечения с помощью стволовых клеток неврологических, аутоиммунных, сердечно-сосудистых и наследственных заболеваний.

Одним из наиболее «горячих» направлений клеточной терапии является адоптивная клеточная иммунотерапия, при которой иммунные клетки программируются на распознавание и уничтожение опухолей. При этом в собственные иммунные клетки пациента in vitro вводят ген, обеспечивающий распознавание «ракового антигена» (молекулы, которой много на раковых клетках, но почти нет на нормальных). После генетической модификации клетки вводят обратно пациенту.

За распознавание антигена отвечают химерные рецепторы антигенов (chimeric antigen receptor, CAR) из-за чего метод называют CAR-технологией [40]. Антиген в теории возможно подбирать индивидуально для каждого пациента, но пока используют некоторые более-менее универсальные для определенных типов опухолей антигены, например CD19 для B-клеточных лимфом. В настоящий момент ведутся клинические испытания около сотни CAR-технологий, а в июле 2017 года одобрение FDA (надзорного органа США по контролю оборота лекарств и пищевых продуктов) получила первая такая технология — для лечения B-лимфом модифицированными T-клетками, нацеленными против антигена CD19.

В России до 2012 года не было юридических норм для большинства технологий клеточной терапии, и разные государственные и коммерческие клиники проводили трансплантацию клеток на свой страх и риск. С 1 января 2017 года у нас вступил в силу закон «О биомедицинских клеточных продуктах». Этот закон регулирует использование только «клеточных линий», то есть стандартизованных клеточных культур, но не затрагивает минимально-манипулированные клеточные продукты. Последние отличаются тем, что при их получении отсутствует стадия культивирования клеток: это ЭКО, трансплантология, трансфузиология, пересадка костного мозга, кожи и т.д. Закон устанавливает правила донорства клеток, их регистрации и проведения клинических испытаний, а также накладывает обязательства по защите пациента. Естественно, что в данном законе детально не прописан регламент регистрации многих инновационных клеточных технологий, для чего сейчас разрабатывают соответствующие подзаконные акты.

В США в 2009 году был снят запрет на использование ЭСК в экспериментальной медицине, но сохранен запрет на государственное финансирование таких исследований (в том числе на использование оборудования, закупленного на государственные средства). В результате в США в 2015 году уже несколько клеточных продуктов на основе ЭСК проходили клинические испытания.

В отличие от США, в некоторых других странах клинические исследования ЭСК и ИПСК легализованы и имеют государственную поддержку. Такими флагманами клеточной терапии являются Япония, Израиль, Испания, Великобритания, Китай, Индия и некоторые другие. В настоящее время зарегистрировано около 20 клинических испытаний, в которых вводили клеточные продукты на основе ЭСК. Больше половины этих исследований использует полученные из ЭСК клетки сетчатки глаза для лечения возрастной слепоты (макулодистрофии). ИПСК на 10 лет «моложе» ЭСК и пока еще не дошли до этих стадий клинических испытаний в качестве методов терапии, но уже активно тестируются в качестве средств диагностики и для апробации лабораторных протоколов их получения и анализа.

Что имеем и чего ждать дальше?

Человек всегда стремился понять устройство живых организмов. Грандиозным шагом на этом пути стало открытие клеточного строения живой материи в XVII веке. Столетия последующих исследований только усложняли картину внутреннего устройства клетки и организма. Сегодня известны практически все клетки, составляющие человеческое тело, все белки и большая часть липидов и сахаров, составляющих клетку. Однако принципы организации и функционирования живых организмов остаются во многом непонятными. Помимо фундаментальных знаний исследования клеток дали множество прикладных технологий, таких как производство вакцин и антител, без которых сложно представить современную медицину. Технологии регенеративной медицины и клеточной терапии сегодня находятся на пороге массового практического применения в медицине.

Технический прогресс тесно связан с фундаментальными открытиям в биологии и медицине. Так, открытие клеточного строения живой материи стало возможным благодаря изобретению микроскопа [4]. Технологии последних 10–20 лет сравнимы по значимости с этим открытием. Прежде всего, это методы получения и культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые позволяют воссоздать (хотя и не полностью) процесс формирования органов in vitro. Немыслимые ранее возможности открывают и новые методы анализа клеток: оптическая микроскопия сверхвысокого разрешения, оптогенетика [25], высокопроизводительное секвенирование [41], масс-цитометрия и др. В совокупности это позволяет ожидать принципиально новых прикладных клеточных технологий и прорывов в понимании принципов организации живого, возможно, даже пересмотров фундаментальных основ биологии.

Календарь

На основе статей спецпроекта мы решили сделать календарь «12 методов биологии» на 2019 год. Эта статья представляет август.

Литература

1. Желудок размером с горошину + человеческий кишечник, выращенный в мыши;
2. Искусственные органы и тканевая инженерия;
3. Органы из лаборатории;
4. 12 методов в картинках: микроскопия;
5. Ствол и ветки: стволовые клетки;
6. Бессмертные клетки Генриетты Лакс;
7. Моноклональные антитела;
8. Была клетка простая, стала стволовая;
9. Нобелевская премия по физиологии и медицине (2012): индуцированные стволовые клетки;
10. In vivo — in vitro — in silico;
11. Примитив не приговор, или Physarum polycephalum разумный;
12. Переход к многоклеточности: GK меняет профессию;
13. Кто рубит коллагеновый лес;
14. Гидроксилапатит — самый главный из фосфатов кальция;
15. Иммунитет: борьба с чужими и… своими;
16. L. Hayflick, P.S. Moorhead. (1961). The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621;
17. L. Hayflick. (1965). The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 37, 614-636;
18. Старение — плата за подавление раковых опухолей?;
19. Молекулярное клонирование, или как засунуть в клетку чужеродный генетический материал;
20. Просто о сложном: CRISPR/Cas;
21. А не замахнуться ли нам на... изменение генома?;
22. От слов к делу: технологию CRISPR-Cas впервые применили для лечения онкозаболеваний;
23. Флуоресцентные белки: разнообразнее, чем вы думали!;
24. Флуоресцентные репортеры и их молекулярные репортажи;
25. Светлая голова;
26. Рулетка для спектроскописта;
27. Лучше один раз увидеть, или Микроскопия сверхвысокого разрешения;
28. Sherman M.I. (1975). Long term culture of cells derived from mouse blastocysts. Differentiation. 3, 51–67;
29. M. J. Evans, M. H. Kaufman. (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156;
30. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145–1147;
31. Снежный ком проблем с плюрипотентностью;
32. В поисках клеток для ИПСК — шаг за шагом к медицине будущего;
33. Свинолюди, крысомыши и другие биотехнологические истории;
34. Kazutoshi Takahashi, Shinya Yamanaka. (2006). Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676;
35. Yoach Rais, Asaf Zviran, Shay Geula, Ohad Gafni, Elad Chomsky, et. al.. (2013). Deterministic direct reprogramming of somatic cells to pluripotency. Nature. 502, 65-70;
36. Kwon D. (2017). Gut organoid transplants produce colorectal cancer in mice. The Scientist;
37. Wadman M. (2013). Medical research: cell division. Nature News;
38. Top drugs by sales in 2016: Who sold the blockbuster drugs? (2017). PharmaCompass;
39. Sanchez-Garcia L., Martín L., Mangues R., Ferrer-Miralles N., Vázquez E., Villaverde A. (2016). Recombinant pharmaceuticals from microbial cells: a 2015 update. Microb. Cell Fact. 15, 33;
40. Т-клетки — марионетки, или как перепрограммировать Т-лимфоциты, чтобы вылечить рак;
41. 12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот;
42. Лаборатория биофизики возбудимых систем: сердце, его вихри и фотоуправление.