Предыстория

В далеком 2006 году, в Киеве, я торжественно вставил в рамку диплом кандидата биологических наук и стал думать, как жить дальше. Вариантов на тот момент было немного — мне очень хотелось заняться иммунологией, а эта область науки требует дорогостоящего оборудования и квалифицированных коллег. Поэтому на тот момент найти хорошую лабораторию я смог только за рубежом. Кстати, в то же время я присоединился к недавно созданному молодому сайту — Биомолекула.ру (если не ошибаюсь, моя учетная запись идет под номером 35).

Итак, я получил приглашение поработать пост-доком в Вайцманновском институте (Израиль), и всё завертелось. Мне повезло: в Израиле я попал в именитую лабораторию и смог освоить самые современные методы, постепенно получив неплохую специализацию в области молекулярной иммунологии клетки. И после трех лет в земле обетованной я попал в США, где получил второй пост-док в одно из отделений Техасского университета (UT Southwestern Medical Center). Мне опять повезло: университет занимается медицинскими исследованиями, в то же время являясь действующей больницей. Это позволило постепенно объединить мои иммунологические исследования с проблемами конкретных пациентов. И хотя я сам не медик и не имею допуска к пациентам, я работаю в составе большой команды специалистов, включающей медиков, генетиков, биоинформатиков и др. Мои обязанности — исследовать молекулярными методами материалы, полученные от пациентов: как правило, это клетки крови или культуры фибробластов кожи. Ниже описан один из таких проектов, который неожиданно для всех нас перерос в нечто гораздо большее.

XLPDR — синдром, про который ничего неизвестно

Как-то раз к нам за консультацией обратились генетики. Они уже давно бились над идентификацией гена, вызывающего очень редкий синдром, названия которому даже нет по-русски, — X-linked reticulate pigmentary disorder (XLPDR). На сегодня известно только около десятка семей во всем мире, в которых отмечены случаи этого заболевания. Болеют только мальчики (болезнь классически сцеплена с Х-хромосомой), ну а девочки являются носителями без каких-либо особо заметных проявлений болезни. Синдром характеризируется пятнистой (похоже на яркие веснушки) и сухой кожей по всему телу (у большинства пациентов хронический ангидроз — с рождения нет потовых желез) и очень специфическим лицом с направленными назад волосами (рис. 1). Однако самое неприятное — помимо фенотипических признаков, у этих пациентов постоянные воспалительные процессы в легких, почках и желудочно-кишечном тракте. Ничего о природе и механизмах этой редкой болезни на момент начала работы не было известно.

...Итак, генетики обратились к нам с просьбой изучить молекулярный механизм синдрома XLPDR. Традиционный быстрый сиквенс генома (сиквенс последовательностей только экзонов, exome sequencing) результатов не приносил, и найти мутацию относительно дешевыми методами генетикам не удавалось. Поэтому нас попросили взглянуть на проблему c точки зрения молекулярной иммунологии — мы как раз тогда только-только опубликовали похожего типа статью, где описали молекулярные изменения во внутриклеточных сигнальных путях у больных с другим редким синдромом — XLID (наследственное слабоумие, тоже сцепленное с Х-хромосомой и тоже проявляющееся только у мальчиков) [1]. То есть мы к тому времени уже имели опыт иммунологических исследований реальных больных «с нуля». Кроме того, как раз двое больных с XLPDR наблюдались в нашей больнице. В общем, мы охотно ввязались в новый проект.

Надежда на быстрый успех

Поначалу дело спорилось: все клеточные линии, полученные от пациентов (фибробласты кожи и клетки крови), показывали на порядки более высокую экспрессию всей палитры иммунологических маркеров-генов. И NF-kB, и интерферон-зависимые гены экспрессировались через край без видимой на то причины. Было похоже, что у больных утратил свои функции некий важный ген-регулятор, и клеткам постоянно чудилось вторжение коварных вирусов, даже когда они росли в стерильных условиях инкубатора. Задокументировав все артефакты, мы стали дожидаться, когда генетики выяснят имя гена, который бы содержал мутацию у всех больных.

Ждать пришлось недолго — поскольку синдром редкий, и геномная ДНК всех известных пациентов была у нас на руках, генетики провели полное секвенирование геномов (whole genome sequencing) всех больных ребят (как уже было сказано, синдром поражает только мальчиков). И внезапно оказалось, что все больные имеют одинаковую точечную замену (SNP) в тринадцатом интроне гена POLA1 — каталитической субъединицы ДНК-полимеразы альфа . Эта полимераза известна всем биологам с университета как фермент, синтезирующий фрагменты Оказаки во время репликации генома. Найденная мутация в интроне гена POLA1 приводит к миссплайсингу пре-мРНК и провоцирует сдвиг рамки считывания (рис. 2). В результате во время трансляции рибосомы налетают на внезапный стоп-кодон, трансляция останавливается, и весь комплекс деградирует. В итоге клетки пациентов содержат очень мало правильной мРНК (только 10–20% от нормы) и, соответственно, очень мало самой полимеразы. Это странно, потому что нехватка полимеразы должна бы быть смертельной (как позже выяснилось, люди выживают только с этой мутацией, а другие мутации в этом же гене, скорее всего, летальны). Однако, на удивление, больные не имели особых дефектов роста или развития, и потому мы просто приняли этот факт во внимание и приступили к дальнейшим поискам — впереди нас ждало еще много неожиданностей.

О нормальной — то есть довольно халатной — работе этого фермента и механизмах закрепления его ошибок в геноме очень доходчиво рассказывает статья «Следы полимеразы α» [2]. — Ред.

Первая загадка

Первая гипотеза — что больные болеют из-за неспособности лимфоцитов при инфекции быстро размножаться и подавлять инфекцию — была опровергнута простым анализом крови. Мы обнаружили, что мутация не влияет на количество иммунных клеток в крови больных, и значит, делятся они нормально. Стало быть, нарушение метаболизма происходит внутри самих клеток, и это каким-то неведомым образом провоцирует иммунный ответ.

И правда — исследовав клетки пациентов, мы нашли, что дефицит полимеразы почему-то приводит к хронической активации многих сигнальных путей. Кроме того, если с помощью специфической киРНК (siRNA) [3] снизить количество POLA1 в нормальных клетках, у них тоже начинается воспаление. Все данные указывали на то, что полимераза POLA1 каким-то образом удерживает клетки от постоянного воспалительного ответа, то есть служит негативным регулятором иммунитета. Оставалось только понять, как такое может быть.

Молекулярная рутина

Дальше пошли бесконечные эксперименты с использованием всего оборудования, до которого мы могли дотянуться. С помощью микроскопии мы обнаружили, что значительная часть белка POLA1 находится в цитоплазме, что для ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, опять же, довольно необычно. Тогда мы (вполне оправданно) стали искать точки соприкосновения POLA1 с другими известными цитоплазматическими регуляторами иммунного ответа. В клетках существует целый ряд иммунных сенсоров и сигнальных путей, и большинство этих белков при активации взаимодействует друг с другом напрямую. Мы даже разработали специальный метод, упрощающий поиск таких взаимодействий [4]. Однако в случае с POLA1 ничего не сработало — полимераза напрямую не входила в состав ни одного известного сигнального пути.

Следующим маневром была попытка определить, какой именно сигнальный путь регулируется полимеразой POLA1. С помощью киРНК мы снижали концентрацию POLA1 в культурах различных нормальных клеток до уровня больных (это называется нокдаун гена) и после этого проверяли, насколько клетки становились чувствительными к тому или иному иммунному стимулу. Надо сказать, клетки человека виртуозно могут распознавать всякую заразу с помощью не одного десятка различных рецепторов, и это существенно осложняет работу. Потому мы последовательно обрабатывали клетки всеми мыслимыми лигандами для толл-подобных рецепторов (TLR; рецепторы заражения, которых у человека с десяток, и каждый «чувствует» присутствие определенного типа бактерий или грибов).

Подборка статей об этих молекулах: «Толл-подобные рецепторы: от революционной идеи Чарльза Джейнуэя до Нобелевской премии 2011 года» [5], «Иммунологическая Нобелевская премия (2011)» [6], «Найти CpG-мотив, или Тонкая работа толл-подобного рецептора 9» [7]. — Ред.

Также мы стимулировали клетки интерлейкином-1 и TNF (универсальными воспалительными факторами, из-за которых у человека повышается температура и наступает болезненная усталость), а также имитировали вирусное заражение (что активирует внутриклеточные ДНК- и РНК-сенсоры, например, RIG-I, MAVS, STING). Логично было предположить, что если определенный сигнальный путь связан с POLA1, клетка с искусственным нокдауном POLA1 должна становиться гиперчувствительной только к определенному лиганду, а действие остальных стимулов не должно особо отличаться от контроля. Однако нас снова ожидал сюрприз: при нокдауне POLA1 большинство клеток приобретало гиперчувствительность ко всем стимулам сразу. Получалось чёрт-те что: никто из нас не слышал о существовании таких глобальных регуляторов всего иммунитета, а главное — мы до сих пор так и не поняли механизм.

Тут у нас закрались серьезные подозрения — вдруг мы прозевали какой-то очевидный фактор, который вызывает такой артефакт? Чтоб исключить возможные влияния на эксперимент наших биополей, барабашек и прочих потусторонних сил, мы обратились в несколько лабораторий с просьбой повторить ключевые опыты. Но все результаты подтвердились независимо от фазы Луны и месторасположения лабораторий. Стало ясно, что мы поймали нечто большее, чем просто мутацию.

Путь во тьме

Приблизиться к раскрытию механизма нам помогла случайность. В описанных выше экспериментах с киРНК мы заметили, что нокдаун POLA1 в одной из самых популярных лабораторных линий клеток — карциномы почки, НЕК293 — не вызывал ожидаемого воспаления. На тот момент мы просто отметили это и переключились на другие линии. Однако теперь мы вспомнили, почему клетки НЕК293 — одна из самых популярных лабораторных клеточных линий: они очень легко трансфецируются любой ДНК. А это происходит в частности из-за того, что в НЕК293 из-за ряда мутаций почти полностью отсутствуют внутренние антивирусные сенсоры, которые узнают проникшие в клетку вирусные молекулы РНК и ДНК. То, что именно эта клеточная линия оказалась единственной невосприимчивой системой к перепадам количества POLA1, дало нам решающую подсказку: наблюдаемый эффект каким-то образом должен быть связан с концентрацией нуклеиновых кислот в цитоплазме и способностью клетки различать нуклеиновые кислоты в цитоплазме по принципу «свой–чужой».

Известно, что клетки очень тщательно контролируют количество нуклеиновых кислот в цитоплазме. При инфекции вирусы впрыскивают свою ДНК (или РНК) внутрь клеток, и клеточные сенсоры распознают чужеродные нуклеиновые кислоты по целому ряду особенностей. При обнаружении чужеродной ДНК/РНК активируется интерфероновая защита — основа антивирусного ответа. Этот процесс включает арест метаболизма (чтобы вирусные частицы не успели собраться), секрецию интерферонов (оповещение соседних клеток и иммунной системы о заражении) и деградацию внутри клеток всего, что выглядит подозрительным (генеральная уборка, назовем это так). И то, что мы видели у клеточных линий больных с нашим синдромом, очень напоминало именно антивирусный ответ — с одной только разницей: клетки находились в стерильных условиях и вирусами не инфицировались.

Теперь, если соединить воедино всё, что мы знали о синдроме, картина наполнялась новым смыслом:

1. POLA1 синтезирует ДНК (в форме фрагментов Оказаки), при этом для синтеза использует нестандартный РНК-праймер.
2. POLA1 в больших количествах находится в цитоплазме клетки.
3. При дефиците POLA1 клетки ведут себя, как будто они заражены вирусами.
4. Клетки, не чувствительные к дефициту POLA1 (это линия НЕК293), не имеют активных систем регистрации вирусных РНК и ДНК, а также РНК:ДНК-химер (которые образуются при обратной транскрипции многих вирусов).

В целом всё указывало на то, что POLA1 каким-то образом уменьшает количество вирусной или собственной (например, ретротранспозонной) РНК или ДНК в цитоплазме. А если POLA1 отсутствует, то «мусорные» нуклеиновые кислоты накапливаются в цитоплазме и хронически активируют антивирусные сигнальные пути, что ведет к постоянному воспалению, которое мы видим у больных.

Это всё логично, но хотелось всё-таки понять механизм работы POLA1. Она не может напрямую уничтожать мусорную ДНК (как это делает ряд ферментов — например, TREX1 [8]), потому что POLA1 — одна из немногих полимераз с неактивным экзонуклеазным доменом. Кроме того, мы должны были научиться определять количество нуклеиновых кислот в цитоплазме, поскольку существующие методы — микроскопия или проточная цитометрия с использованием специфических антител к ДНК — работали на наших моделях из рук вон плохо, ведь нас интересовала только цитоплазма, а ядро, полное нуклеиновых кислот, неизменно давало очень высокий фоновый сигнал.

Сказка о потерянном времени

Параллельно возникла еще одна проблема: ввиду «горячей» информации (ведь на тот момент самым главным, что мы открыли, была мутация в гене POLA1) и большого количества соавторов, нас постоянно торопили с публикацией того, что есть — иначе любой другой генетик мог случайно наткнуться на интересную мутацию и опубликовать статью, тем самым нивелировав ценность наших изысканий.

Мы начали ощущать неслабое давление — мол, давайте не гнаться за топовыми журналами, опубликуем что есть в средненьком генетическом издании, а позже спокойно найдем механизм и опубликуем еще раз, тоже в хорошем молекулярном журнале. Нам (мне и моему руководителю) пришлось проявить недюжинные политические качества, убеждая коллабораторов в том, что мы почти закончили и что волноваться не стоит, и еще у нас есть парабеллум... Однако настроения это не поднимало — мы действительно не знали, с какой стороны подойти к механизму, а время всё утекало. Каждый новый вариант проверки требовал двух-трех месяцев напряженной работы, и у нас оставалось максимум две-три попытки до того момента, как коллабораторы потеряют последнее терпение.

Зеленый свет

Пасьянс сложился как-то вдруг. У нас уже был под рукой полный набор антител к нуклеиновым кислотам: к двух- и одноцепочечной ДНК, а также к РНК:ДНК-гибридным молекулам. Антитела работали неплохо, но мы не могли придумать нормального метода регистрации. И вдруг нас осенило: если цитоплазматическую фракцию клеток отделить от ядер (это легко), то тогда с помощью антител можно очистить именно цитоплазматические ДНК или ДНК:РНК. А если антитела прикрепить к сефарозным шарикам (Protein-G agarose beads — реактив, который традиционно используют в лабораториях для аффинной хроматографии), то эти шарики можно просто окрасить специфическим красителем для нуклеиновых кислот (с изобретением qPCR таких красителей продается много, и мы выбрали PicoGreen, потому что он зеленый и красивый), а потом сравнить уровни свечения под обычным микроскопом с ультрафиолетовой лампой.

Значит, если в цитоплазме много молекул ДНК или РНК:ДНК, шарики будут светиться ярко-зеленым, а если мало — то бледно-зеленым. Быстро обкатав методику, мы начали сравнивать цитоплазму в различных здоровых клетках и в клетках наших пациентов с синдромом XLRPD.

Первый же эксперимент поразил нас: у здоровых клеток в цитоплазме оказалось очень-очень много цитоплазматической РНК:ДНК. В цитоплазме же клеток наших больных РНК:ДНК-молекул не было практически совсем (рис. 3)! Ровно противоположный результат тому, что мы ожидали. Однако нас уже было не остановить.

Убедившись, что главное различие между здоровой клеткой и клеткой с дефицитом POLA1 — это загадочная РНК:ДНК в цитоплазме, мы в который раз с запозданием хлопнули себя по лбу. Ведь что гласит университетский курс по молекулярной биологии: фрагмент Оказаки — основной продукт POLA1 — представляет собой небольшую РНК-затравку, к которой полимераза добавляет ДНК-нуклеотиды. Получается, что POLA1 в свободное от репликации время синтезирует подобные РНК:ДНК-комплексы в цитоплазме.

Мы попробовали очистить эти цитоплазматические химеры и трансфецировать их в клетки больных синдромом XLPDR. Действительно, после этого воспаление на время пропадало. А значит, POLA1 постоянно синтезирует некие иммунологически инертные РНК:ДНК-комплексы (размером около 100 пар нуклеотидов), которые служат неким «белым шумом», не давая цитоплазматическим сенсорам перевозбуждаться из-за незначительных утечек нуклеиновых кислот, например, из ядра или при повреждении митохондрий. И только когда концентрация подозрительной ДНК превышает уровень шума, вся антивирусная система и запускается. По всему выходило, что задача POLA1 — постоянно производить «нуклеиновый шум», чтобы не допускать ложного срабатывания интерферонового ответа.

Публикация, в натуре

Мы сделали это! Обычно в сказках и в подростковых фильмах на этом месте начинаются титры, и герои уходят в даль, на закат. Увы, в реальности так элегантно не получается.

Во-первых, большинство было настроено скептически относительно публикации в топовом журнале — конкуренция там огромная, и любая даже очень хорошая статья может застрять на этапе рецензии на многие месяцы. Во-вторых, написать и оформить статью под подачу в каждый журнал занимает около месяца. А писать, естественно, приходилось нам самим — несмотря на обилие соавторов, реальную помощь оказывали единицы.

Мы начали по старшинству: август 2015 года — Science. Ответ через две недели — нет. Сентябрь 2015 — переписанная статья пошла в Nature. Ответ через полторы недели — нет. Октябрь 2015 — Nature Immunology, статья снова переписана и рисунки переделаны. И вдруг нам улыбнулась удача — ответ редактора пришел почти сразу: «Мне нравится, но давайте посмотрим, что скажут рецензенты». Через неделю все три рецензента ответили одинаково — будем брать. А дальше события развивались фантастически быстро: ответить на основные замечания у нас заняло всего месяц — почти все комментарии были по делу, и бόльшая часть материала у нас уже была на руках (мы его не включали в статью по причине экономии места, ведь объем текста и рисунков жестко регламентирован). Переделанная версия была отправлена на суд рецензентов, и позитивный ответ мы получили уже на следующий день. После трех лет работы над проектом это была поистине королевская награда [9]!

По-вашему, это финал?

Конечно, наша идея про РНК:ДНК-дуплексы в роли «нуклеинового шума» пока что только рабочая гипотеза. Мы до сих пор не смогли определить последовательность нуклеотидов в этих дуплексах, поэтому не представляем их источника и мишеней внутри клеток. Идея про «нуклеиновый шум» хоть и элегантна, но тоже еще не доказана. И в целом, вопросов на данный момент больше, чем ответов. Но одним из результатов этой работы всё-таки уже можно гордиться: мы теперь можем генотипировать сестер больных ребят — чтобы определить, являются ли они носителями мутации или могут не опасаться иметь детей в будущем. И мы наконец смогли рассказать десяти больным, почему они больны и что с ними не так, и теперь можем подсказать их лечащим врачам, в какую сторону следует корректировать их метаболизм. Потому что это ужасно — знать, что у тебя редкая болезнь, о которой известно одно лишь название. Да и то — до сих пор не переведенное на русский.

Литература

1. Petro Starokadomskyy, Nathan Gluck, Haiying Li, Baozhi Chen, Mathew Wallis, et. al.. (2013). CCDC22 deficiency in humans blunts activation of proinflammatory NF-κB signaling. J. Clin. Invest.. 123, 2244-2256;
2. Следы полимеразы alpha;
3. Обо всех РНК на свете, больших и малых;
4. Starokadomskyy P. and Burstein E. (2014). Bimolecular affinity purification — a variation of TAP with multiple applications. Methods Mol. Biol. 1177, 193–209;
5. Толл-подобные рецепторы: от революционной идеи Чарльза Джейнуэя до Нобелевской премии 2011 года;
6. Иммунологическая Нобелевская премия (2011);
7. Найти CpG-мотив, или Тонкая работа толл-подобного рецептора 9;
8. Daniel B. Stetson, Joan S. Ko, Thierry Heidmann, Ruslan Medzhitov. (2008). Trex1 Prevents Cell-Intrinsic Initiation of Autoimmunity. Cell. 134, 587-598;
9. Petro Starokadomskyy, Terry Gemelli, Jonathan J Rios, Chao Xing, Richard C Wang, et. al.. (2016). DNA polymerase-α regulates the activation of type I interferons through cytosolic RNA:DNA synthesis. Nat Immunol. 17, 495-504.